A role of hyaluronan of different molecular weights in the physiology of dermal fibroblasts

Bc. Ing. Lucie Vištejnová, Ph.D.

Doctoral thesis

Abstract:

Hojení ran je komplexní a dynamický proces řízený množstvím cytokinů, chemokinů, růstových faktorů a komponent extracelulární matrix (ECM). Narušení rovnováhy v působení těchto molekul může vést k prodloužení hojícího procesu nebo ke vzniku chronické rány. Ze složek ECM, kyselina hyaluronová (HA), patří mezi důležité regulační účastníky hojení. Při vzniku rány je přirozeně se vyskytující vysokomolekulární HA (HMW HA) degradována na nízkomolekulární HA (LMW HA) fragmenty působením volných kyslíkových radikálů nebo aktivovanými hyaluronidázami. O LMW HA se předpokládá, že podporuje pro-zánětlivé chování buněk, zatímco HMW HA zachovává homeostázu tkáně. Napovídají tomu současná pozorování, kdy pro-zánětlivá odpověď imunitních buněk může být modulována fragmenty LMW HA. Dále se předpokládá, že dermální fibroblasty, primárně zodpovědné za eliminaci nefunkční a produkci nové ECM během hojení, aktivně participují na regulaci imunitní odpovědi. Na základě těchto informací vznášíme hypotézu, že LMW HA může modulovat proces hojení pomocí regulace fyziologie dermálních fibroblastů. Na úvod práce jsme provedli srovnání impedanční techniky měření buněčné viability s běžně používanými metodami detekce formazanu a vnitrobuněčného ATP. Impedanční technika se ukázala jako vhodná pro měření viability 3T3 linie fibroblastů, HaCaT linie keratinocytů i primokultury dermálních fibroblastů (NHDF), neboť srovnání této metody s metodami detekce formazanu nebo ATP poskytlo srovnatelné výsledky. Naopak, viabilita primokultury epidermálních keratinocytů (NHEK) měřená impedanční technikou s běžnými metodami nekorelovala, což lze připsat specifické morfologii buněk primárních keratinocytů. Z testovaných technik měření viability metoda detekce formazanu byla použita pro evaluaci vlivu HA o různých molekulových hmotnostech (MW) na viabilitu NHDF. Žádná z testovaných MW HA (4.3 kDa, 31 kDa, 55 kDa, 115 kDa, 223 kDa, 329 kDa, 698 kDa a 1.1 MDa) významně neovlivnila viabilitu NHDF, což může být důsledek vysoké čistoty a kvality připravené HA a jejího přirozeného výskytu v tkáních. Dále jsme v této práci zkoumali roli HMW HA (1.1 MDa) a středně velkých (MMW) a krátkých (LMW) fragmentů HA (4.3 kDa – 698 kDa) v reakci NHDF. Při migračním in vitro „scratch wound“ testu HA s MW > 300 kDa stimulovala migraci NHDF a HA s MW ~ 55 kDa zvyšovala expresi genů integrinů a produkci HA syntázy 2. Dále, byla pozorována zvýšená produkce pro-zánětlivého cytokinu IL-6 a chemokinů IL-8, CXCL1, CXCL2, CXCL6, CCL2 and CCL8 vlivem LMW HA (4.3 kDa) a žádná stimulace nebo snížená produkce vlivem HMW HA (1.1 MDa). Blokování exprese CD44 pomocí siRNA vedlo k potlačení produkce IL-6 a chemokinů u NHDF ovlivněných LMW HA, což naznačuje zapojení CD44 v aktivaci NHDF. Význam pro-zánětlivých mediátorů produkovaných LMW HA stimulovaných NHDF byl potvrzen aktivací leukocytů a jejich produkcí pro-zánětlivých IL-6 a TNF-α. Tato práce dokazuje, že NHDF v prostředí fragmentů HA aktivně participují na regulaci procesu hojení rány. Je to dokumentováno daty ukazující jednak stimulaci in vitro migrace NHDF vlivem fragmentů HA, a dále stimulaci produkce pro-zánětlivých mediátorů LMW HA ovlivněných NHDF, které následně podporovaly vrozenou imunitní odpověď u leukocytů.

Abstract:

Wound healing is a complex and dynamic process governed by a variety of cytokines, chemokines, growth factors and components of extracellular matrix (ECM). A disruption of an equilibrium in the action of these molecules leads into improper wound resolution. Among components of ECM, hyaluronic acid (HA) is suggested to be an important regulatory player in the healing process. Within injury, the naturally occurred high molecular weight HA (HMW HA) is degraded into low molecular weight HA (LMW HA) fragments by reactive oxygen species or by activated hyaluronidases. LMW HA is supposed to stimulate pro-inflammatory behavior of cells participating in wound healing, whereas HMW HA maintains tissue homeostasis. Particularly, recent knowledge indicates that the pro-inflammatory response of immune cells can be modulated by LMW HA fragments. However, current data propose that also dermal fibroblasts, a cell type responsible for an elimination of damaged and production of new ECM in wound healing, participate actively in the regulation of immune response. Therefore we hypothesize that LMW HA can modulate the wound healing process through the regulation of dermal fibroblast physiology. First of all, impedance-based method of cell viability measurement was compared with established techniques of reduced formazan detection and intracellular ATP detection. The impedance-based method was found to be applicable for the determination of the cell proliferation of 3T3 fibroblast line, HaCaT keratinocyte line and normal human dermal fibroblasts (NHDF), since the comparison of this method with ATP and formazan determinations showed comparable results. In contrast, the proliferation of normal human epidermal keratinocytes (NHEK) measured by the impedance-based method did not correlate with other methodological approaches, which could be accounted to the specific morphological appearance of these cells. From tested approaches, formazan based assay was used for evaluation of effect of HA of various MW (4.3 kDa, 31 kDa, 55 kDa, 115 kDa, 223 kDa, 329 kDa, 698 kDa and 1.1 MDa) on a viability of NHDF. None of MW HA significantly affected the viability of NHDF indicating its in-toxicity which could result from high quality preparation and isolation procedure as well as from natural occurrence of HA in tissue. Next, we investigated the role of HMW HA (1.1 MDa) and low and middle fragments of HA (4.3 kDa – 698 kDa) in the response of NHDF. Within scratch wound assay, HA of MW > 300 kDa stimulated NHDF migration and HA of MW ~ 55 kDa potentiated the expression of adhesion integrin genes and the production of HA synthase 2. Further, we observed elevated expression of pro-inflammatory cytokine IL-6 and chemokines IL-8, CXCL1, CXCL2, CXCL6, CCL2 and CCL8 by NHDF after LMW HA (4.3 kDa) treatment and no stimulation or even decrease after HMW HA (1.1 MDa) treatment. The down-regulation of CD44 expression by siRNA resulted in the attenuation of IL-6 and chemokines expression in LMW HA treated NHDF suggesting the involvement of CD44 in LMW HA mediated NHDF activation. The importance of pro-inflammatory mediators produced by LMW HA triggered NHDF was evaluated by significant activation of blood leukocytes exhibited as increased production of IL-6 and TNF-α. Conclusively, this thesis proved that NHDF supported by HA fragments actively participate in the regulation of wound healing process. It is documented by our data showing the stimulation of NHDF in vitro migration under influence of HA fragments, and the production of pro-inflammatory mediators by LMW HA triggered NHDF followed by an encourage of the innate immune response.

Keywords

Hyaluronic acid, fibroblasts, wound healing, inflammation, chemokines, CD44, kyselina hyaluronová, fibroblasty, hojení ran, zánět, chemokiny

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 1. 7. 2014

Thesis defence

• Date of defence: 18. 9. 2014
• Supervisor: doc. Mgr. Lukáš Kubala, Ph.D.
• Reader: doc. MUDr. Milena Králíčková, Ph.D., doc. MUDr. Daniel Lysák, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Science

Doctoral programme / field:
Biology (4-years) / Animal Physiology