DNA kvadruplex formující segmenty v nekodujících oblastech FGFR3 genu.

Bc. Šimon Džatko

Master's thesis

DNA quadruplex forming segments in noncoding regions of FGFR3 gene.

Abstract:

FGFR3 protein hraje klíčovou roli ve vývoji kostry a chrupavek prostřednictvím negativní regulace proliferace a diferenciace chondrocytů. Tyrozin kinázová aktivita FGFR3 spouští signalizační kaskádu v PLCγ1, RAS/MAPK a PI3K/Akt signálních dráhách. Somatické mutace v FGFR3 genu jsou příčinou nemalého množství různých vývojových ochoření, včetně skeletálních dysplazií. Kromě toho je mutantní FGFR3 také faktorem způsobujícím nádorové bujení několika druhů rakovin, včetně rakoviny močového měchýře, rakoviny varlat, rakoviny hlavy a krku a také mnohočetného myelomu (MM). I přes nemalý počet strategií pro cílení aberantní signalizace FGFR3, efektivní terapie ochoření způsobených touhle signální dráhou zatím není v klinické praxi dostupná. G-kvadruplexy (G4) jsou nekanonické sekundární struktury nukleových kyselin, vyskytující se především v nekódujících oblastech DNA, zejména v blízkosti počátku transkripce (TSS) a v prvních intronech genů. V posledních letech byla u některých genů experimentálně prokázána role G4 formujících segmentů v regulaci genové exprese. V této práci byla studována možnost regulace exprese FGFR3 prostřednictvím G4 formujících segmentů v nekódujících oblastech FGFR3 genu. Vliv účinku G4 stabilizující sloučeniny Pyridostatin na tři MM buněčné linie s nadměrnou expresí FGFR3 byl detegován na úrovni proteinu, stejně jako na úrovni FGFR3 mRNA. Downregulace exprese endogenního FGFR3 na úrovni proteinu i mRNA byla pozorována u KMS18 a KMS11 buněk, zatímco žádný účinek nebyl pozorován u OPM2 buněk. Pro určení vlivu G4 formujících segmentů v promotorové oblasti FGFR3 genu byla provedena Luciferázová reportérová esej s různými úseky proximální promotorové oblasti. Relativní aktivita promotorových reportérů byla testována v transfekovaných MM buněčných liniích. Výsledky reportérové eseje poukazují na možnou roli G4 formujících segmentů v blízkosti TSS (5' konec pred TSS, v prvním UTR a v prvním intronu) v regulaci FGFR3 exprese.

Abstract:

FGFR3 play pivotal role in skeletal development, where it negatively regulates chondrocyte proliferation and differentiation. Tyrosine kinase (TK) activity of FGFR3 triggers downstream signaling cascades in PLCγ1, RAS/MAPK and PI3K/AKT pathways. Activating somatic mutations in fgfr3 gene results in FGFR3 being involved in several developmental syndromes, including skeletal dysplasias. Moreover, mutant FGFR3 drives tumor survival and progression in several cancers, including urothelial, testis, head and neck cancer and multiple myeloma (MM). Despite the whole range of strategies for targeting aberrant FGFR3 signaling, the effective therapy of FGFR3 related malignancies in clinical routine is not available in these days. G-quadruplexes (G4s) are non-canonical secondary structures of nucleic acids, found mainly in non-coding regions of DNA, especially in proximity of Transcription Start Site (TSS) and in first introns of genes. In recent years, the regulatory function of G4s in genetic expression has been experimentally proven for several genes. In this study, the possibility of regulation of FGFR3 expression through direct regulation of fgfr3 gene expression via G4 forming segments in fgfr3 non-coding regions was evaluated. The impact of treatment of three MM cell lines overexpressing FGFR3 with G4 stabilizing compound Pyridostatin (PDS) was examined on protein level, as well as FGFR3 mRNA level. The downregulation of expression of FGFR3 on protein and mRNA level was observed in KMS18 and KMS11 cells, while no effect was observed in OPM2 cells. For evaluation of impact of G4 segments in proximal promoter region of fgfr3 gene, the luciferase reporter assay with different fgfr3 promoter constructs was performed. Relative promoter activity was tested in transfected MM cell lines. Results from reporter assay suggested possible involvement of G4 forming segments near the TSS (5´-upstream of TSS, in first UTR and in first intron) in the regulation of FGFR3 expression.

Keywords

FGFR3 signaling, Multiple myeloma, Skeletal dysplasia, G-quadruplex, non-coding DNA, regulation of gene expression, FGFR3 signální dráha, Mnohočetný myelom, Skeletální dysplázia, G-kvadruplex, nekódující DNA, regulace genové exprese

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 12. 5. 2016

Thesis defence

• Date of defence: 20. 6. 2016
• Supervisor: doc. Mgr. Lukáš Trantírek, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Science

Master programme / field:
Physics / Biophysics