Induction of stemness by depletion of histone variant macroH2A1 in hepatocellular carcinoma

Oriana Lo Re, Ph.D.

Doctoral thesis

Abstract:

Hepatocelulární karcinomy (HCC - Hepatocellular carcinoma) obsahují subpopulace rakovinných kmenových buněk (CSC - cancer stem cells), které vykazují rysy podobné kmenovým buňkám a jsou odpovědné za relapsy nádoru, metastázování a chemorezistenci. Vývoj účinných způsobů léčby HCC bude záviset na molekulárním porozumění specifických cest vedoucích k vzniku CSC fenotypu. MacroH2A1 je variantou histonu H2A a je epigenetickým regulátorem funkce kmenových buněk, ve kterých podporuje diferenciaci a zároveň působí jako bariéra přeprogramování somatických buněk [1]. V histologických řezech lidských HCC jsme odhalili významnou korelaci mezi nízkými hladinami macroH2A1 a pokročilými subtypy HCC, které se vyznačují vysokou agresivitou a málo diferencovanými buňkami. Nízké hladiny macroH2A1 byly taktéž detekovány pomocí imunoznačení v lidských HCC s charakteristikami podobnými rakovinovým kmenovým buňkám. S použitím HCC buněčných linií jsme zjistili, že knockdown macroH2A1, připravený pomocí shRNA, indukuje u těchto buněk CSC fenotyp. Zjistili jsme, že jsou-li HCC buňky s macroH2A1-KD (knockdown), injikovány do nu-nu myší postradajících thymus, vyznačují se pak tyto buňky ve srovnání s kontrolními HCC liniemi zvýšeným rakovinným potenciálem. Na histologické úrovni se nádory vytvořené z buněčných linií macroH2A1-KD vyznačovaly oproti kontrolním liniím méně diferencovanou architekturou a s více pleomorfními jádry. Nicméně, macroH2A1-KD buňky vykazovaly pomalejší proliferaci a celkově byly morfologicky menší ve srovnání s kontrolními buněčnými liniemi. Zároveň jsme také pozorovali subcelulární ultrastrukturální změny, jako jsou kapičky lipidů v cytoplazmě a autofagosomové formace. Další charakteristiky podobné CSC v HCC buňkách po KD macroH2A1 zahrnovaly zvýšené hladiny mRNA tzv. Přeprogramovacích genů (detekované pomocí qPCR), a zvýšenou expresi faktoru HIF1α (hypoxia inducible factor 1 α), detekovaného pomocí ELISA, který podporuje růst nádoru [2]. HCC buňkách (HepG2) s KD pro macroH2A1 jsme také hodnotili dlouhodobou proliferaci, energetický metabolismus a centrální metabolismus uhlíku. Buňky macroH2A1-KD byly necitlivé na vyčerpání séra z kultivačního média a vykazovaly dvě odlišné, ale vzájemně závislé změny v metabolismu glukózy a lipidů v CSC: i) nadprodukce acetyl-coA, která se transformuje na zvýšený obsah lipidů, a ii) zvýšenou aktivaci pentosofosfátové dráhy k produkci prekurzorů pro syntézu nukleotidů. Integrace výsledků RNA sekvenování a metabolických analýz odhalilo klíčovou úlohu signalní dráhy LXR (Liver X Receptor pathway),jejiž inhibice měla za následek ztrátu CSC vlasnosti u macroH2A1-KD buněk. CSC hrají důležitou roli u zprostředkováné lékové rezistence pozorované po chemoterapii a v úniku před imunitním systémem (immune evasion). V tomto ohledu jsme se pokusili identifikovat specifické faktory vylučované jaterními CSC a určit i) jejich vliv na sousední buňky a ii) jejich signálizační a epigenetické mechanismy, které řídí jejich produkci. Pomocí hmotnostní spektromentrie byly nalezeny významně změněné metabolické procesy v macroH2A1-KD buňkách (Huh-7) ve srovnání s kontrolními buňkami. Ztráta exprese macroH2A1 by mohla parakrinním způsobem přeprogramovat rodičovské HCC buňky na chemorezistentní CSC fenotyp. Naše funkční a imunologické analýzy na macroH2A1 odvozeném CSC sekretomu naznačují, že tento epigenentický mechanismus by mohl poskytnout souvislost mezi propagací kmenovosti v mikroprostředí nádoru (TME) a únikem nádorových buněk imunitní odpovědi.

Abstract:

Hepatocellular carcinomas (HCC) contain a sub-population of cancer stem cells (CSCs), which exhibit stem-cell like features and are responsible for tumor relapse, metastasis, and chemoresistance. The development of effective treatments for HCC will depend on a molecular-level understanding of the specific pathways driving CSC emergence and stemness. MacroH2A1 is a variant of the histone H2A and an epigenetic regulator of stem cell function, where it promotes differentiation and, conversely, acts as a barrier to somatic cell reprogramming [1]. In human HCC sections, we uncovered a significant correlation between low frequencies of macroH2A1 staining and advanced, aggressive HCC subtypes with poorly differentiated tumor phenotypes. Immune staining for macroH2A1 on human HCCs with stem-like characteristics express low levels of macroH2A1. Using HCC cell lines, we found that short hairpin RNA–mediated macroH2A1 knockdown induces acquisition of CSC‐like features. We found that macroH2A1 knocked down (KD) HCC cell lines, when inoculated into athymic nude mice, have an enhanced tumorigenic potential compare to the control HCC cell lines. At the histological level, the tumors from macroH2A1-KD cell lines presented less differentiated architecture with more pleomorphic nuclei compared to control cell–derived tumors. However, macroH2A1 KD HCC cells showed slower proliferation and appeared smaller compared to control cell lines. We also observed subcellular ultrastructural changes such as lipid droplets and auto phagosome formations. Other CSC-like characteristics in HCC cells following KD of macroH2A1 included increased mRNA levels of reprogramming genes, detected by qPCR, and increased expression of hypoxia inducible factor 1 α (HIF1α), detected by ELISA, which promote tumor progression [2]. We assessed also long-term proliferation, energy metabolism, and central carbon metabolism in HCC cells (notably HepG2 cells) depleted of macroH2A1. MacroH2A1-depleted HCC cells were insensitive to serum exhaustion and showed two distinct, but interdependent changes in glucose and lipid metabolism in CSCs: i) overproduction of acetyl-coA that is transformed into enhanced lipid contents and ii) increased activation of the pentose phosphate pathway, diverting glycolytic intermediates to provide precursors for nucleotide synthesis. Integration of metabolomics analyses with RNA-Seq data revealed a key role for the Liver X Receptor pathway, whose inhibition resulted in attenuated CSCs-like features. CSCs have an important role in mediating drug resistance following chemotherapy and in immune evasion. In this respect we finally sought to identify the specific factors secreted by hepatic CSCs and to determine i) their influence on neighbouring cells, and ii) the signaling and epigenetic mechanisms that control their production. Significantly altered metabolites were found in HCC cells KD for macroH2A1 (notably Huh-7 cells) compared to control cells, by performing ultra-high performance liquid chromatography. The loss of macroH2A1 expression could reprogram parental HCC cells to a CSC-like chemoresistant phenotype in a paracrine manner. Our functional and immunological analyses on the macroH2A1-dependent CSC-like secretome suggest that this epigenetic pathway might provide an under-appreciated link between cancer stemness propagation in the tumor microenvironment (TME), and tumor cell evasion from adaptive immune surveillance.

Keywords

histonové varianty, nádorové kmenové buňky, hepatocelulární carcinom, epigenetika, Histone variants, cancer stem cells, hepatocellular carcinoma, and epigenetics.

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 13. 12. 2019

Thesis defence

• Date of defence: 31. 1. 2020
• Supervisor: PhD. Manlio Vinciguerra
• Reader: Dr Hervé Guillou, Dr. Anna Alisi, PhD

Masaryk University

Faculty of Medicine

Doctoral programme / field:
Biomedical sciences / Biochemistry and Molecular Biology