Aplikace NMR spektroskopie v metabolomice

RNDr. Helena PELANTOVÁ

Doctoral thesis

Application of NMR spectroscopy in metabolomics

Abstract:

Předložená disertační práce se zabývá studiem myších modelů obezity a diabetu pomocí NMR metabolomiky na vzorcích moči. V první části byly na sadě 19 metabolitů v reálných vzorcích optimalizovány tři parametry experimentálního protokolu: způsob odběru moči, pulsní sekvence pro snímání protonových spekter a způsob jejich normalizace. Pro myší modely s indukovanou obezitou se ukázal jako nejvýhodnější 24hodinový odběr moči bez přístupu k potravě, vzhledem k výskytu proteinů v myší moči následovaný Car-Purcell-Meiboom-Gill pulsní sekvencí a normalizací spekter na celkovou plochu. Takto naměřená NMR data byla v dalších studiích vyhodnocována kombinací metod multivariační statistické analýzy a parametrických i neparametrických testů; statisticky významné metabolity byly identifikovány srovnáním s databázemi spekter. NMR metabolomika na modelu obezity indukované glutamanem monosodným (MSG) prokázala četné změny v moči MSG myší, zejména změněný metabolismus nikotinamidu a polyaminů, sníženou sekreci močových proteinů a rozdíly v koncentracích allantoinu, methylaminu a fenylacetylglycinu. V průběhu stárnutí bylo pozorováno přiblížení hladin kreatinu, citrátu, acetátu a sukcinátu hodnotám kontrolních myší. Rozvoj obezity a insulinové rezistence byl ve věku šesti měsíců potvrzen biochemickými parametry a indikován také změnami expresí mRNA odpovídajících enzymů v tukové tkáni. Antidiabetická léčba metforminem, vildagliptinem a jejich kombinací se u myší s dietou indukovanou obezitou projevila poklesem hladiny plasmatické glukosy a snížením hmotnosti jater. Multivariační analýza NMR dat identifikovala významné rozdíly především v hladinách N-karbamoyl-beta-alaninu, acylglycinů, glukosy a metabolitů N-methylnikotiamidu. Korelace těchto signifikantních metabolitů s biochemickými parametry označila vhodné markery diabetu pro tento model. Nejdůležitější z nich, N-karbamoyl-beta-alanin, byl v této souvislosti jako potenciální biomarker popsán poprvé. NMR metabolomika umožnila také vyhodnotit efektivitu jednotlivých terapií; jako nejúčinnější potvrdila léčbu kombinovanou. Výsledky této práce mohou přispět k pochopení molekulární podstaty obezity a diabetu a posléze k optimalizaci účinných terapeutických postupů.

Abstract:

This doctoral thesis is focused on the study of mouse models of obesity and diabetes using NMR-based metabolomics. At first, three parameters of the experimental protocol were optimized in the set of 19 metabolites in real samples: urine collection protocol, pulse sequence for proton spectra acquisition, and normalization method. The 24h urine collection on mice with no access to food, followed by Car-Purcell-Meiboom-Gill (CPMG) pulse sequence for spectra acquisition and their normalization to the total spectral area was determined as the most advantageous in mouse models with induced obesity. Acquired NMR data were subsequently evaluated using the combination of multivariate statistical methods with parametric and nonparametric tests. The most significant metabolites were identified by comparison with spectral databases. NMR metabolomics applied in the model of monosodium glutamate (MSG) - induced obesity revealed numerous changes in urine of MSG-treated mice, mainly the altered metabolism of nicotinamide and polyamines, attenuated excretion of major urinary proteins, and fluctuating concentrations of allantoin, phenylacetylglycine, and methylamine. Altered levels of creatine, citrate, acetate, and succinate iterated to the values of control mice during aging. The development of obesity and insulin resistance at the age of six months was confirmed by biochemical parameters and manifested by changes in mRNA expressions of the corresponding enzymes in adipose tissue. Antidiabetic therapy with metformin, vildagliptin and their combination attenuated the levels of plasma glucose and reduced liver weight in mice with diet-induced obesity. Multivariate analysis of NMR data revealed substantial changes mainly in concentration of acylglycines, glucose, N-carbamoyl-beta-alanine and N-methylnicotinamide metabolites. Correlation of significant metabolites with the results of glucose tolerance test indicated suitable markers of diabetes for this model. In this study N-carbamoyl-beta-alanine was for the first time reported as a potential marker of diabetes. NMR-based metabolomics enabled us to evaluate the effectiveness of different therapies and the combined treatment has been identified as the most effective one. The results of these studies can contribute to our understanding of the molecular basis of obesity and diabetes and to possible optimization of therapeutic approaches.

Keywords

NMR, metabolomika, myší model, obezita, diabetes, moč

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 21. 12. 2015

Accessible from:: 21. 12. 2015

Thesis defence

• Supervisor: prof. Ing. Vladimír Havlíček, Dr.

PALACKÝ UNIVERSITY OLOMOUC

Faculty of Science

Doctoral programme / field:
Chemistry / Analytical Chemistry