Charakterizace mutanta mitogen-aktivované proteinkinasy 3 z Arabidopsis thaliana připraveného technologií CRISPR/Cas9

Lenka JANÁLOVÁ

Bachelor's thesis

Characterization of Arabidopsis thaliana mitogen-activated protein kinase 3 mutant prepared by Crispr/CAS9 technology

Abstract:

Kaskády mitogen-aktivovaných proteinkinas jsou zapojeny do odpovědi rostlin na různé podněty, především na biotický a abiotický stres. Pomocí přenosu signálu dochází k regulaci růstu a vývoje rostlin. Tímto způsobem je zajištěna adaptace na nepříznivé podmínky v okolním prostředí. Součástí těchto kaskád je i mitogen-aktivovaná proteinkinasa 3, která je aktivována různými vnějšími faktory, například kyselinou abscisovou, reaktivními kyslíkovými radikály, působením těžkých kovů, při osmotickém stresu nebo elicitory patogenů. V této práci byli použiti mutanti Arabidopsis thaliana mpk3-5 s žádoucí mutací v genu MPK3 připravené metodou CRISPR/Cas9. Tento nástroj pro cílenou editaci genomu, založený na CRISPR a s ním asociované nuklease (Cas9) pocházející z bakterie Streptococcus pyogenes, byl použit pro vytvoření dvojitých zlomů v DNA s následnou aktivací opravných mechanizmů, při kterých může dojít ke vzniku mutace v požadované sekvenci DNA. Hlavním cílem této práce byla selekce homozygotních mutantů mpk3-5 ve vybraných liniích 1/14 a 1/17 a následným sekvencováním určit typ mutace v sekvenci genu MPK3. Vzorky identifikovaných mutantních linií byly podrobeny semikvantitativní RT-PCR pro zjištění, zdá dochází k tvorbě transkriptu MPK3. Dále byla ověřena nepřítomnost proteinu MPK3 v homozygotních liniích mutanta mpk3-5. Na závěr byly homozygotní linie v T3 generaci použity pro zkoumání vlivu solného stresu na růst mutantních rostlin A. thaliana.

Abstract:

Mitogen-activated protein kinase (MAPK) cascades are included in plant response to various extracellular stimuly, especially to biotic and abiotic stress. MAPK signal transmission regulates the growth and development of plants. By this way adaptation to unfavorable environmental conditions is ensured. These cascades also include mitogen-activated protein kinase 3 (MPK3), which is activated by many external factors including abscisic acid, reactive oxygen species, heavy metal pollution, osmotic stress and pathogen elicitors. Arabidopsis thaliana mutants called mpk3-5 with required mutation in MPK3 gene prepared by CRISPR/Cas9 method were used in this work. This tool used for target editing of the genome based on CRISPR and CRISPR-associated nuclease (Cas9) originating from bacterium Streptococcus pyogenes is used to create double strand breaks in DNA with subsequent activation of repair mechanisms that may result in a mutation in the desired DNA sequence. Main aim of this work was election of mpk3-5 homozygous mutants in 1/14 and 1/17 lines and determination of mutation type in MPK3 gene by subsequent sequencing. Identified mutant lines were subjected to semiquantitative RT-PCR to know if MPK3 transcript is present. Then absence of MPK3 protein was confirmed in mpk3-5 homozygous mutant lines. Finally, homozygous lines in the T3 generation were used to investigate the effect of salt stress on the growth of mutant A. thaliana plants.

Keywords

Mitogen aktivované proteinkinasy (MAPKs), Arabidopsis thaliana, MPK3, abiotický stres, solný stres

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 10. 5. 2018

Thesis defence

• Supervisor: Mgr. Veronika Zapletalová, Ph.D.

PALACKÝ UNIVERSITY OLOMOUC

Faculty of Science

Bachelor programme / field:
Biochemistry / Biotechnology and Gene Engineering