Characteristics and regulation of lung stem cells

Anas Rabata, M.Sc.

Disertační práce

Anotace:

Centrální osu řízení vývoje a regenerace plic tvoří signální dráha fibroblastového růstového faktoru (fibroblast growth factor, FGF) a její interakce s dráhami epidermálního růstového faktoru (EGF) a signalizací WNT. Plné pochopení buněčné hierarchie v dospělých plicích a vliv signálů z mikroprostředí na sebe obnovu a diferenciaci dospělých plicních kmenových/progenitorových buněk (lung stem/progenitor cells, LSPCs) však zatím chybí. Proto jsme připravili detailní návod k různým způsobům zpracování plicní tkáně pro následnou detekci a/nebo izolaci LSPCs. Dále jsme pro modelování přirozených procesů regulujících homeostázu plicní tkáně vytvořili systémy pro 3D kultivaci struktur získaných z LSPCs ve fyziologickém prostředí, a to plicních sfér (lungosphere assay) a plicních organoidů (lung organoid assay). Za použití těchto 3D kultivačních technik jsme prozkoumali zapojení drah FGF, EGF a WNT do regulace růstu a diferenciace LSPCs a následné morfogeneze plicní tkáně. V neadherentních podmínkách zapříčinila signalizace FGF vznik řady fenotypově různých plicních sfér. Pomocí ultrastrukturální a imunohistochemické analýzy jsme ukázali, že v plicních sférách vznikají z LSPCs více diferencované dceřiné buňky. Při kultivaci LSPCs ve 3D extracelulární matrix podporovala signalizace FGF vznik organoidů s úseky alveolární tkáně a úseky připomínajícími tkáň bronchiolů, přičemž měla signalizace EGF podpůrný vliv. Různé FGF se lišily ve svých účincích, konkrétně FGF7 a FGF10 způsobili vznik větších a více větvených organoidů s výraznější diferenciací distálních typu plicních buněk, než FGF2 a FGF9. Při srovnání architektury, buněčného složení a genové exprese vzniklých tkání vyšlo najevo, že zatímco signalizace WNT zvyšuje incidenci vzniku organoidů, signalizace FGF má vliv především na funkční diferenciaci buněk. V následné detailní studii jsme pomocí hyperstabilních mutantních molekul FGF2 (FGF2-STAB) ukázali vliv stability molekuly FGF2 na buněčnou proliferaci, potřebnost heparinu pro vazbu FGF2 na receptor (FGFR) a na dynamiku ERK1/2 signalizace, která zprostředkovává signály z FGFR uvnitř buněk. Ve srovnání s neupraveným FGF2 (FGF2-wt) se FGF2-STAB ukázal být méně závislý na heparinu jako kofaktoru pro indukci a stabilizaci signalizace přes FGFR. Při testování na BaF3 buňkách, které exprimují FGFR, účinkoval FGF2-STAB jako efektnější induktor buněčného dělení a ukázal nižší afinitu k heparinu. Prozkoumáním dynamiky signalizace ERK1/2 jsme zjistili, že FGF2-STAB je potentnější a rychlejší aktivátor ERK1/2 signalizace než FGF2-wt, a to zejména při nízkých koncentracích. Ve 3D kulturách se stabilní formy FGF2 a FGF10 ukázaly jako účinnější pro podporu vzniku plicních organoidů a plicních sfér. Dohromady naše zjištění připívají lepšímu pochopení úlohy FGF, EGF a WNT signalizace pro regeneraci plicní tkáně a mohou vést k případným novým regenerativním a terapeutickým možnostem.

Abstract:

Fibroblast growth factor (FGF) signaling pathway and its interaction with epidermal growth factor (EGF) and WNT signaling pathways form the central regulatory axis during lung development and regeneration. However, our understanding of cellular hierarchy in adult lung and microenvironmental signaling pathways that regulate adult epithelial lung stem/progenitor cells (LSPCs) self-renewal and differentiation remains incomplete. Therefore, here we provided a detailed description of different tissue dissociation and flow cytometry strategies for the detection and isolation of LSPCs. Furthermore, we established 3D cell culture models in order to model processes of lung tissue maintenance in a physiologically relevant microenvironment, including LSPC-derived lungospheres (lungosphere assay) and LSPC-derived organoids (lung organoid assay). In this study, we investigated the role of FGF, EGF, and WNT signaling in regulation of LSPCs fate and morphogenesis using 3D cell culture models and imaging. In non-adherent conditions, FGF signaling promoted formation of several distinct phenotypes of lungospheres from LSPCs. Ultrastructural and immunohistochemical analyses showed that LSPCs produced more differentiated lung cell progeny. In 3D extracellular matrix, FGF signaling promoted lung organoid formation that organized alveolar-like and airway-like structures, while EGF signaling played a supportive role in FGF-induced lung organoid formation. Interestingly, FGF7 and FGF10 generated bigger organoids, induced more branching, and were potent inducers of more distal cell types than FGF2 or FGF9. Analysis of tissue architecture, cell type composition, and gene expression revealed that WNT signaling significantly increased the efficiency of lung organoid formation, whereas FGF singling regulated the differentiation. Moreover, we demonstrated the effect of FGF2 stability on cell proliferation, heparin requirement for induction of FGF-FGFR signaling, and dynamics of FGFR-ERK1/2 signaling using hyperstable FGF2 variants (FGF2-STABs). In comparison to wild-type FGF2 (FGF2-wt), FGF2-STABs were less dependent on heparin for stabilization and induction of FGFR signaling. Using cell proliferation assays of BaF3-FGFR cells, FGF2-STAB displayed more efficiency in inducing cells proliferation and lower affinity for heparin than FGF2-wt. Evaluation of the ERK1/2 signaling dynamics revealed that at low concentrations, the ERK1/2 signaling activation was more potent and faster in response to FGF2-STABs than in response to FGF2-wt. Application of FGF2-STAB or FGF10-STAB in 3D cell culture models enhanced lung organoid and lungosphere formation efficiency. Altogether, our findings contribute to a better comprehension of the role of FGF, EGF, and WNT signaling in regenerative capacity of the lung and might lead to potential novel regenerative and therapeutic strategies.

Keywords

3D kultura, plicní epitel, signalizace FGF, plicní sféra, plicní organoid, signalizace WNT, 3D culture, lung epithelial cells, FGF signaling, lungosphere, lung organoid, WNT signaling

Jazyk práce: angličtina

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 4. 9. 2020

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 9. 11. 2020
• Vedoucí: Mgr. Zuzana Koledová, Ph.D.
• Oponent: doc. RNDr. Vladimír Divoký, Ph.D., Professor Gunilla Westergren-Thorsson

Masarykova univerzita

Lékařská fakulta

Doktorský studijní program / obor:
Biomedicínské vědy / Morfologie buněk a tkání