Inženýrství makromolekulárního komplexu rezonančně přenášejícího energii bioluminiscenčního záření

Bc. Daniel Pluskal

Diplomová práce

Engineering of a macromolecular bioluminescence resonance energy transfer complex

Anotace:

Optické bioeseje a biozobrazovací metody umožňují přímočarou a vysoce citlivou in vivo vizualizaci rozličných biologických jevů, jinak obtížně pozorovatelných, za pomoci fluorescence či bioluminiscence s původem v proteinech. Přeze své výhody jsou oba tyto mechanismy světelné emise provázeny nedostatky, které limitují jejich praktické využití, a jsou tak žádoucí potlačit. V současnosti nejslibnějším řešením je propojení funkce biokompatibilních fluorescenčních a bioluminiscenčních proteinů skrze vysoce účinný rezonanční přenos bioluminiscenční energie (BRET), dovolující přímé pohánění světelného výstupu fluorescenčního proteinu prostřednictvím bioluminiscenční reakce, což bioluminiscenci stabilizuje a zesiluje, umožňuje její vylepšování a eliminuje potřebu intenzivního excitačního záření. V rámci této práce byl navržen, zkonstruován a z hlediska funkce optimalizován soběstačný geneticky zakódovatelný fúzní protein schopný stabilní bioluminiscence zprostředkované pomocí BRET, pro použití jako reportér. Návrh fúzního proteinu byl proveden na základě krystalografické struktury přechodného přirozeného komplexu luciferasy a zeleného fluorescenčního proteinu z renily fialové (Renilla reniformis), což vedlo ke konstrukci fúzního proteinu s vylepšenými vlastnostmi in vitro ve srovnání s předchozími pokusy o dosažení podobného cíle na základě metody pokus-omyl.

Abstract:

Optical bioassays and bioimaging methods enable straightforward and highly sensitive in vivo visualisation of various biological phenomena otherwise challenging to observe, utilising protein-based fluorescence or bioluminescence. Despite their benefits, both of these mechanisms of light emission are accompanied by disadvantages limiting their practical use, which are, therefore, desirable to suppress. Nowadays, the most promising solution is to interconnect the function of biocompatible fluorescent and bioluminescent proteins via the highly efficient bioluminescence resonance energy transfer (BRET), allowing the light output of the fluorescent protein to be powered directly by the bioluminescent reaction, which stabilises and amplifies the bioluminescence, allows for its fine tuning, and eliminates the need for intensive excitation radiation. Within this thesis, we designed, constructed, and functionally optimised a standalone genetically encodable fusion protein capable of stable BRET-mediated bioluminescence for use as a reporter. The design was performed on the basis of the crystallographic structure of the transient native complex of the luciferase and green fluorescent protein from Renilla reniformis, leading to a construction of a fusion protein which showed superior properties in vitro in comparison to previous trial-and-error-based attempts to achieve similar results.

Keywords

Renilla reniformis, luciferasa, luciferase, zelený fluorescenční protein, green fluorescent protein, fúzní protein, fusion protein, rezonanční přenos energie bioluminiscenčního záření, bioluminescence resonance energy transfer, BRET, zobrazování bioluminiscencí, bioluminescence imaging, proteinové inženýrství, protein engineering, charakterizace enzymu, enzyme characterisation, optimalizace enzymových vlastností, enzyme properties optimisation

Jazyk práce: angličtina

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 18. 5. 2023

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 16. 6. 2023
• Vedoucí: Ing. RNDr. Martin Marek, Ph.D.
• Oponent: doc. Mgr. Pavel Dvořák, Ph.D.

Masarykova univerzita

Přírodovědecká fakulta

Magisterský studijní program / obor:
Biochemie / Biochemie