Duchennova svalová dystrofie: Analýza stresu endoplazmatického retikula zapříčiněného absencí dystrofinu v kmenových buňkách

Bc. Tomáš Urban

Master's thesis

Duchenne muscular dystrophy: Analysis of Endoplasmic Reticulum stress caused by the absence of dystrophin in stem cells

Abstract:

Dystrofin jako část dystrofin glykoproteinového komplexu, který spojuje cytoskelet svalových buněk s extracelulární matrix, má významnou roli ve správné struktuře buněk. Mutace v jeho genu zapříčiní závažné genetické onemocnění zvané Duchenova svalová dystrofie (DMD) s incidencí přibližně 1:5000, popřípadě méně závažnou formu zvaná Beckerova svalová dystrofie (BMD). Příznaky DMD jsou pomalý rozvoj kosterních svalů začínajícího kolem čtyř let věku s jejich následným ochabováním a také rozvoj srdečního selhání v průběhu druhé dekády života pacientů. Kolem třicá-tého roku života vede rozvoj těchto symptomů ke smrti pacientů. Minulá bakalářská práce, na kterou tato práce navazuje, poukázala na využití nespecifického induktoru stresu dithiotreitolu (DTT) a jeho vlivu na strukturu Golgiho aparátu a následné kumulace proteinu dystrofinu v něm. Tato práce se zaměřuje na vyvolání stresu endoplazmatického retikula (ER) pomocí specifických induktorů thapsigarginu a tunicamycinu na lidských embryonálních (hESC) a lidských indukovaných pluripotentních kmenových buňkách (hiPSC) a srovnání míry stresu s buňkami s Duchennovou svalovou dystrofií pomocí sledování proteinů zprostředkující odpověď na stres ER. Díky výsledkům jsem poukázal na zvýšené bazální množství proteinu BiP/GRP78 značící perzistentní ER stres u hiPSC derivovaných z pacientů trpících DMD (DMD-hiPSC). DMD-hiPSC taktéž vykazovaly signifikantně zvýšenou odpověď na induktory ER stre-su v porovnání s kontrolními hiPSC. Také jsem sledoval trendy zvyšující se odpovědi při použití induktorů ER stresu o vyšších koncentracích v rámci jednotlivých linií. Neprokázal jsem účinek UDCA, který by napomohl ke snížení ER stresu.

Abstract:

Dystrophin, as part of the dystrophin glycoprotein complex, which connects the cytoskeleton of muscle cells to the extracellular matrix, plays an important role in proper cell structure. Mutations in his gene cause a serious genetic disease called Duchenne muscular dystrophy (DMD) with an incidence of approximately 1: 5000, or a less severe form called Becker's muscular dystrophy (BMD). The symptoms of DMD are the slow development of skeletal muscles beginning around four years of age with their subsequent weakening, as well as the development of heart failure during the second decade of patients' lives. Around the age of thirty, the development of these symptoms leads to the death of patients. The last bachelor's thesis, which is followed by this work, pointed to the use of a non-specific stress inducer dithiothreitol (DTT) and its effect on the morphology of the Golgi apparatus and the subsequent accumulation of dystrophin protein in it. This work focuses on inducing endoplasmic reticulum (ER) stress using specific inducers thapsigargin and tunicamycin on human embryonic (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) and a comparison of stress levels with Duchenne muscular dystrophy cells by monitoring of proteins mediating the ER stress response. Thanks to the results, I showed an increased basal amount of BiP / GRP78 protein indicating persistent ER stress in hiPSCs derived from patients with DMD (DMD-hiPSC). DMD-hiPSCs also showed a significantly increased response to ER stress inducers compared to control hiPSCs. I also observed trends of increasing response when using ER stress inducers at higher concentrations within individual lines. I have not shown an effect of UDCA that would help reduce ER stress.

Keywords

dystrofin, Duchennova svalová dystrofie, stres endoplazmatického retikula, lidské embryonální kmenové buňky, lidské indukované kmenové buňky, thapsigargin, tunicamycin, dystrophin, Duchenne muscular dystrophy, endoplasmic reticulum stress, human embryonic stem cells, human induced pluripotent stem cells

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 19. 5. 2022

Thesis defence

• Date of defence: 21. 6. 2022
• Supervisor: Mgr. Vladimír Rotrekl, Ph.D.
• Reader: Ing. Josef Jaroš, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Science

Master programme / field:
Biochemistry / Genomics and Proteomics