Integrita DNA spermií býků ve vztahu k jejich kryokonzervaci

Bc. Hana Pavlíčková

Master's thesis

DNA integrity of bull sperm in relation to their cryopreservation

Abstract:

Při kryokonzervaci spermií dochází k řadě nežádoucích procesů, které mohou způsobit změnu mimo jiné i na jejich DNA. K poškození integrity DNA však může dojít ještě před procesem kryokonzervace. Jedná se například o vliv přítomnosti cytoplazmatické kapky, vyšší teploty v nadvarleti a věku. Mimo tyto uvedené vlivy je to rovněž laboratorní zpracovávání spermií, dále typ použitého kryoprotektantu, rychlost zmrazení a rozmrazování. Hodnocení integrity DNA se ukazuje velmi objektivním diagnostickým a prognostickým ukazatelem reprodukčního potenciálu, jelikož až 15 % plemeníků nemá konvenční analýzu v pořádku, ovšem hodnocení integrity DNA není jednoduché zařadit do konvenčního hodnocení kvůli nákladům na pořízení. Cílem práce bylo vyhodnotit vliv kryokonzervace na integritu DNA spermií býků a stanovit míru korelace dvou vybraných metod použitých pro její hodnocení, jelikož se v případě postupu využívající toluidinovou modř jedná o finančně dostupnou metodu s potenciálem využití v praxi.Ejakulát byl odebírán standardním způsobem pěti býkům na inseminační stanici. Poté byl transportován do laboratoře, kde byl naředěn a zpracován před a následně po kryokonzervaci. Hodnocení integrity DNA probíhalo pomocí metody založené na principu barvení pomocí toluidinové modři (TB) a pomocí fluorescenční metody založené na metachromatických vlastnostech akridin oranž (AO), jejichž souvztažnost byla vyhodnocena korelační analýzou. Vliv kryokonzervace na integritu DNA byl prokázán. Průměrná hodnota pozitivních spermií před kryokonzervací pomocí AO byla 1,375 % a spermií po kryokonzervaci 15,1 %. Při barvení pomocí TB bylo procento pozitivních spermií před kryokonzervací 9,2 % a spermií po kryokonzervaci 16,08 %. Dále byla zjištěna korelace metod AO a TB, přičemž Pearsonův koeficient korelace vyšel 0,64, což značí silnou závislost. Dále byla při porovnání býků potvrzena individuální variabilita. Obě hypotézy byly potvrzeny. Kryokonzervace měla vliv na integritu DNA spermií býků. Použité metody spolu korelovaly, což představuje potenciální možnost použití méně nákladné metody založené na barvení toluidinovou modři v praxi.

Abstract:

During the cryopreservation of sperm, a number of unwanted processes may occur, which can cause, among other things, changes in their DNA. However, damage of DNA integrity may occur before the cryopreservation process. These include, for example, the influence of cytoplasmic drops, higher temperature in epididymis and age. In addition to these effects, it is also laboratory sperm processing, the type of cryoprotectant used, the rate of freezing and thawing. DNA integrity assessment is a very objective diagnostic and prognostic indicator of reproduction potential, as up to 15 % of breeding males do not have conventional analysis all right, but the DNA integrity assessment is not easy to include in a conventional evaluation due to high costs. The aim of the thesis was to evaluate the effect of cryopreservation on the integrity of bovine sperm DNA and to determine the correlation between the two selected methods, which were used for its evaluation., since When the toluidine blue procedure is a financially available method with potential for use in practice .Ejaculate was collected in a standard way from five bulls at the insemination centre. Then, it was transported to a laboratory, where it was diluted and analyzed before and after cryopreservation. DNA integrity assessment was performed using a toluidine blue (TB) staining based method and a fluorescent method based on the metachromatic properties of acridine orange (AO). Their relationship was evaluated by correlation analysis.The impact of cryopreservation on DNA integrity has been demonstrated. The mean value of positive sperm before cryopreservation with AO method was 1,375 % and 15,1 % after cryopreservation. For method using TB, the percentage of positive sperm before cryopreservation was 9,2 % and 16,08 % after cryopreservation. Furthermore, the correlation between AO and TB was found, with the Pearsons coefficient of correlation being 0,64, indicating a strong correlation. In addition, individual variability was confirmed when bulls were compared.Both hypotheses have been confirmed. Cryopreservation had an effect on the integrity of bovine sperm DNA. The used methods correlated, suggesting the potential of usinga cheaper method based on toluidine blue staining in practice.

Keywords

DNA, Kryokonzervace, Reprodukce, Spermie

Keywords

DNA, cryopreservation, reproduction, sperm

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 10. 4. 2018

Thesis defence

• Supervisor: Ing. Ondřej Šimoník

Czech University of Life Sciences Prague

Faculty of Agrobiology, Food and Natural Resources

Master programme / field:
Biotechnology / Reproduction Biotechnology