Separace, koncentrace a izolace fragmentů DNA pomocí elektromigračních technik

Bc. Markéta Vaňková

Master's thesis

Separation, concentration and isolation of DNA fragments using electromigration separation techniques

Abstract:

Elektromigrační separační metody zahrnují velké množství technik, které jsou využívány v mnoha oblastech lidské činnosti. Výjimkou není ani analýza DNA, kde mohou být tyto metody aplikovány v analytickém i preparativním měřítku. Vývoj nových metod pro separaci, čištění a koncentraci DNA je například potenciálně přínosný pro oblast tekuté biopsie. Zde se předpokládá, že extrakce vybraných fragmentů DNA z biologického vzorku může vést ke zefektivnění diagnostiky nádorových onemocnění. Tato diplomová práce se zaměřuje na využití dvou elektromigračních metod – kapilární gelové elektroforézy s laserem indukovanou fluorescenční detekcí (CGE-LIF) a epitachoforézy (ETP). V první části práce je vyvinuta metoda pro CGE, která umožňuje separaci především krátkých fragmentů DNA do 1 kb. Jako separační médium byly použity roztoky lineárního polyakrylamidu v základním elektrolytu. DNA fragmenty byly fluorescenčně značeny pomocí barviva SYBR Gold. Bylo ověřeno, že tuto metodu lze v laboratorním měřítku využít jako alternativu k dražší komerční analýze. Druhá část práce se zabývá testováním nového typu zařízení pro ETP, které je unikátní svým designem. Jedinečnost nového zařízení je v jeho konstrukci – bude používáno jako vyjímatelný nástavec do přístroje pro plošnou elektroforézu. ETP může být obecně využita jako metoda pro extrakci DNA, a to v módu izotachoforézy i elektroforézy. Dle zvolených podmínek lze dosáhnout koncentrace nebo separace DNA. Práce se zaměřuje na testování funkčnosti nového designu pro ETP i elektroforézu, volbu gelového stabilizačního média, odběr frakcí DNA a výtěžnost.

Abstract:

The term “electromigration separation techniques” stands for a large group of separation methods used in many areas of human activity. One of them is DNA analysis, where these methods can be applied for both analytical and preparative purposes. For example, the development of new extraction techniques is potentially beneficial in the field of liquid biopsy. It is assumed that isolation of selected DNA fragments from biological sample could increase the efficiency of this type of cancer diagnostics. This thesis focuses on the use of two electromigration methods – capillary gel electrophoresis with laser-induced fluorescence detection (CGE-LIF) and epitachophoresis (ETP). In the first part of the thesis, CGE method is developed that allows separation mainly of short DNA fragments with length up to 1 kb. Linear polyacrylamide solutions prepared in background electrolyte were used as a sieving medium. DNA fragments were labelled with SYBR Gold fluorescent stain. It has been verified that the developed CGE method can be, on a laboratory scale, used as an alternative to a more expensive commercial analysis. Second part of the thesis deals with testing of a new type of ETP device. The uniqueness of the new device is in its design and structure since it will be used as a removable extension for horizontal gel electrophoresis device. Generally, ETP can be used as a DNA extraction method, either in isotachophoretic or electrophoretic mode. Depending on the initial conditions, DNA concentration or separation is possible. The thesis focuses on testing of functionality of the new ETP device, the choice of gel stabilisation medium, DNA sampling options and DNA yield.

Keywords

elektromigrační metody, kapilární gelová elektroforéza, epitachoforéza, analýza DNA, extrakce DNA, tekutá biopsie, ctDNA, electromigration methods, capillary gel electrophoresis, epitachophoresis, DNA analysis, DNA extraction, liquid biopsy

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 4. 1. 2023

Thesis defence

• Date of defence: 25. 1. 2023
• Supervisor: Mgr. Ivona Voráčová, Ph.D.
• Reader: Mgr. Miroslava Bittová, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Science

Master programme / field:
Biochemistry / Analytical biochemistry