Molekulární detekce patogenů u hematoonkologických pacientů

Mgr. Kristýna Hrnčířová, Ph.D.

Doctoral thesis

Detection of pathogens in hematooncological patients using methods of molecular biology

Anotácia:

Invazivní mykotická onemocnění (IFD, invasive fungal diseases) jsou velmi závažnou život ohrožující komplikací léčby imunokompromitovaných pacientů. Pro prognózu nemocných je zásadní včasná diagnostika a zahájení cílené antimykotické léčby. Samotná diagnostika je velmi komplikovaná a v současné době je založena na kombinaci klinických příznaků, radiologického nálezu a výsledků mikrobiologických testů. Velký rozvoj však v posledních letech zaznamenává diagnostika využívající metody molekulární biologie, zejména PCR a její modifikace. I přes desítky publikovaných prací však pro PCR diagnostiku IFD není jednoznačně doporučován žádný standardizovaný protokol ani komerční souprava. Situace je komplikována vysokou odolností buněčné stěny mikromycet vůči rozrušení, fungální DNA bývá ve vzorku i při invazivní infekci velmi malé množství a velkým problémem je také riziko kontaminace vzorků mikromycetami přítomnými v okolním prostředí v průběhu celého analytického procesu (od odběru vzorku až po vlastní PCR amplifikaci). Cílem předkládané dizertační práce bylo zavedení nových postupů pro PCR detekci klinicky nejvýznamnějších vláknitých plísní v klinických vzorcích u hematoonkologických nemocných. V laboratořích Centra molekulární biologie a genové terapie Interní hematologické a onkologické kliniky Fakultní nemocnice Brno a Masarykovy univerzity byly do rutinní praxe postupně zavedeny metodiky pro izolaci fungální DNA z kultur a klinických vzorků a PCR metod pro detekci Aspergillus spp. a mukormycet, což významně přispělo ke zkvalitnění celkové diagnostiky invazivních mykotických infekcí na tomto pracovišti. Došlo také k navázání spolupráce s jinými pracovišti v České a Slovenské Republice a ve světě. Výsledky práce byly prezentovány na řadě významných českých i zahraničních odborných konferencí a publikovány v českých časopisech i v impaktovaných zahraničních časopisech. Výsledkem soustavné práce na této problematice je také udělení českého patentu a podání mezinárodní patentové přihlášky týkající se PCR metodiky pro detekci Aspergillus spp. Tato práce je komentovaným souborem publikací doktoranda.

Abstract:

Invasive fungal diseases (IFD) are serious life – threatening complication in imunocompromised patients. Early diagnostics and initiation of targeted antifungal therapy are very important for patient´s outcome. Diagnostics of these infections is very complicated, based on combination of clinical and radiological findings and results of microbiology methods at this time. A progress can be seen in the area of molecular biology methods in the last decade. But, there is still no recommended standardized protocol or commercial kit for PCR diagnostics in general. This situation is complicated by high resistance of fungal cell wall to disruption, there is a very low amount of fungal DNA even in samples taken during invasive infection and very important problem is a risk of possible contamination of samples with air – borne fungi during the whole analytical process (from sample taking to PCR amplification). The main goal of this thesis was to establish new methods for PCR diagnostics of the clinically most important fungal pathogens in haematooncological patients. As a result, methods for fungal DNA isolation from culture and clinical samples and methods for PCR detection of Aspergillus spp. and mucormycetes were established in the laboratory of Centre of Molecular Biology and Gene Therapy (Department of Internal Medicine – Haematooncology, University Hospital Brno and Masaryk University). This made an important contribution to enhancement of the diagnostics of invasive fungal infections at this department. Also, important cooperations with other departments in the Czech Republic and Slovak Republic and in the world were established. Results of this work were presented at many important Czech and international congresses and published in the Czech and international journals with impact factor. Result of the systematic work is also an award of Czech patent and submission of international patent concerning the methodology of Aspergillus spp. PCR detection. This work is a commented set of student's publications.

Kľúčové slová

PCR, invazivní mykotické infekce, diagnostika

Jazyk práce: Czech

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 9. 1. 2013

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 29. 3. 2013
• Vedúci: doc. Mgr. Martina Lengerová, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Medicine

Doctoral programme / odbor:
Oncology (4-years) / Oncology