Funkční analýza prometastatických proteinů u renálního karcinomu

Bc. Aneta Anýžová

Master's thesis

Functional analysis of prometastatic proteins in renal cell carcinomas

Abstract:

Renální karcinom je zhoubné onemocnění ledvin s nejvyšší úmrtností ze všech močopohlavních onemocnění. Při jeho klasifikaci a výběru vhodné léčby pro pacienta je klíčová znalost biomarkerů, které by mohly přispět ke zvýšení efektivity terapie. V teoretické části je popsána biologie, současná terapie RCC, principy v práci použitých metod a charakteristika vybraného markeru. V experimentální části je popsána analýza dat validačního souboru 96 lokalizovaných RCC tkání metodou „selected reaction monitoring“ (SRM) na panelu 84 proteinů souvisejících s relapsem na základě předchozí studie (panel L). Tento panel a dále panel M obsahující 59 proteinů souvisejících se špatnou odpovědí na léčbu tyrozin kinázovými inhibitory na základě předchozí studie souboru metastatických RCC byly dále analyzovány v souvislosti s vlivem hypoxie na hladiny těchto proteinů v 6 buněčných liniích – 786-0, A704, CAKI-1, RCC-MF, RCC-KP a RCC-FG2. V rámci statistického vyhodnocení bylo u buněčných linií porovnáváno několik způsobů normalizace dat: normalizace na medián a normalizace na „housekeeping“ (HK) proteiny a jejich kombinace. Trendy intenzit proteinů se při použití různých způsobů normalizace neměnily. Výběr konkrétního HK proteinu, resp. jejich kombinací neměl na výsledné trendy zásadní vliv. Pomocí SRM dat bylo validováno 10 proteinů z 84 souvisejících s relapsem do pěti let od nefrektomie, z nichž 4 měly zvýšenou hladinu u pacientů s relapsem. Z těchto 4 proteinů 2 vykázaly souvislost s hypoxií na panelu buněčných linií, z nichž byl na základě biologické úlohy vybrán TIMP1 jako protein vhodný pro další funkční analýzu. Kódující gen TIMP1 byl pomocí metody CRISPR/Cas9 v linii CAKI-1 úspěšně umlčen a byl připraven klon CAKI-1_TIMP1 s delecí 14 pb v kódující oblasti. Ztráta exprese byla potvrzena i pomocí imunoblotingu. Ztráta TIMP1 měla vliv na proliferaci buněk klonu. Vliv TIMP1 na migraci byl studován pomocí migračního testu (scratch assay). Z důvodu retrakce rodičovských buněk nebylo možné porovnat chování rodičovských buněk s TIMP1 klonem. Vliv na migrační a invazivní vlastnosti buněk bude dále studován. Práce ukazuje potenciál SRM pro validaci proteinů souvisejících s relapsem nádorových onemocnění a představuje vyvinutý modelový systém připravený k dalším funkčním studiím.

Abstract:

Renal cell carcinoma is a malignant kidney disease with the highest mortality of all genitourinary diseases. Knowledge of biomarkers that could increase the effectiveness of targeted therapy is very important to its classification and selection of appropriate treatment of the patients. Theoretical part of the thesis describes the biology, current therapy of RCC, the principles of used methods and the characteristics of a selected biomarker. The experimental part describes the data analysis of the validation set of 96 localized RCC tissues obtained by “selected reaction monitoring” (SRM) method on a panel of 84 relapse-related proteins based on a previous study (panel L). This panel and an additional panel M containing 59 proteins associated with a poor response to tyrosine kinase inhibitors treatment based on a previous study of metastatic RCC were further analyzed in connection with hypoxia effect on the protein levels in 6 RCC cell lines – 786-0, A704, CAKI-1, RCC-MF, RCC-KP and RCC-FG2. As part of the statistical evaluation, several methods of data normalization were compared in RCC cell lines: normalization on median and normalization on “housekeeping” (HK) proteins and their combinations. Protein signal did not change in response to different normalization methods used, and the selection of a specific HK protein or their combination did not have a major impact on the resulting trends. Using SRM data, 10 out of 84 proteins related to relapse within five years after nephrectomy were validated. The level of 4 proteins of these proteins were elevated in relapsed patients. Two of these proteins had an association with hypoxia in panel of RCC cell lines, from which TIMP1 was selected as a protein suitable for further functional analysis based on its biological role. TIMP1 coding gene was successfully silenced in the CAKI-1 cell line, and a CAKI-1_TIMP1 clone was prepared with 14 bp deletion in coding sequence. The loss of expression was also confirmed by immunoblotting. The loss of TIMP1 affected clone cell proliferation. The effect of TIMP1 on migration was studied using a migration test (scratch assay). Due to the retraction of the parental cells, it was not possible to compare the behaviour of the parental cells with the TIMP1 clone. The effect on the migration and invasion capacity will be further studied. The thesis describes the potential of SRM for validation of relapse-related proteins and presents a developed model system for further functional studies.

Keywords

Renální karcinom, proteinové biomarkery, TIMP1, housekeeping proteiny, relaps, buněčné linie, CAKI-1, renal cell carcinoma, protein biomarkers, housekeeping proteins, relapse, cell lines

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 18. 5. 2023

Thesis defence

• Date of defence: 15. 6. 2023
• Supervisor: doc. Mgr. Pavel Bouchal, Ph.D.
• Reader: Mgr. Jakub Faktor, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Science

Master programme / field:
Biochemistry / Biochemistry