The role of stem cells in development of heart failure associated with Duchenne muscular dystrophy

Mgr. Šárka Jelínková, Ph.D.

Doctoral thesis

Abstract:

Duchennova svalová dystrofie (DMD) je genetické onemocnění způsobené ztrátou funkčního dystrofinu. Většina pacientů s DMD trpí rozvojem fibrózy myokardu a vývojem dilatační kardiomyopatie vedoucí k srdečnímu selhání a předčasné smrti. Přestože během posledních desetiletí byl popsán mechanismus vedoucí ke smrti kardiomyocytů, propojení ztráty dystrofinu s opožděným vývojem kardiomyopatie je stále nejasné. Pro experimenty bylo využito indukovaných pluripotentních kmenových buněk (lPKB) získaných od DMD pacientů reprogramací, nebo zavedením DMD mutace do zdravé linie lidských embryonálních kmenových buněk pomocí CRISPR/Cas9 technologie. Tyto linie byly následně diferencované do kardiomyocytů za pomocí protokolu diferenciace 3D shluků lPKB. Současné důkazy naznačují, že rozvoj symptomů DMD je asociován s dysfunkcí či deplecí progenitorových buněk. Ze studovaných kardiomyoctů odvozených z lPKB DMD pacientů jsme získali data o dysfunkci srdečních buněk, ale ne o vývoji onemocnění. Soustředili jsme se proto dále na stadium progenitorových buněk nesoucích DMD mutaci. Pro analýzu srdečních kmenových buněk (SKB) bylo použito srdce od pacienta nesoucího mutaci v dystrofinu a podstupujícího srdeční transplantaci. V orgánu byla zjištěna změna v množství a funkčních charakteristikách SKB. Tyto výsledky byly potvrzené na modelovém organism mdx myši kde byla take pozorována zvýšená incidence zlomů DNA ukazující, že ztráta SKB je spojená s poškozením DNA. Molekulární podstata fenotypu pozorovaného na SKB byla odkryta za použití modelu lPKB odvozených z DMD pacientů. Zajímavým zjistěním byla exprese dystrofinu již v lPKNB u zdravých pluripotentních linií a následně i to, že jeho ztráta vede k deregulaci aktivity všech tří izoforem syntázy oxidu dusnatého (NOS). To ve svém důsledku vede ke zvýšení produkce reaktivích kyslíkových radikálů (ROS), které dále vede ke zvýšenému výskytu oxidativního poškození DNA bází. Vliv aktivity NOS na produkci ROS a poškození DNA bylo prokázáno inhibicí NOS, vedoucí k opětovnému snížení produkce ROS i ke snížení poškození DNA. Dále byla dokázána asociace exprese dystrofinu se zvýšenou mutagenezí lPKB, ukazující ztrátu dystrofinu jako factor vedoucí k deregulaci aktivity NOS zvyšující produkci ROS které následně způsobuje poškození DNA a mutagenezi. Naše výsledky ukazují, že vývoj srdečního selhání u DMD je asociován s deplecí SKB a že tyto mají poškozenou DNA. Toto poškození DNA bylo u lPKB spojeno se zvýšenou produkcí ROS díky deregulaci aktivity NOS způsobenou ztrátou exprese dystrofinu. Genomové poškození DMD buňky v pluripotentním stavu a současně u progenitorových buněk ukazuje, že dystrofin hraje klíčovou roli v lPKB, ale také dalších kmenových buňkách vyžadujících expresi dystrofinu a požadujících zachování stability genomu.

Abstract:

Duchenne muscular dystrophy (DMD) is a genetic condition characterized by the loss of functional dystrophin. Majority of the DMD patients develops heart muscle fibrosis and dilated cardiomyopathy, eventually leading to heart failure and premature death. Although several molecular mechanisms leading to the DMD cardiomyocyte (CM) death were described during the recent decades, the link between dystrophin deficiency and delayed onset of cardiomyopathy is still unclear. We used DMD patient-specific induced pluripotent stem cell model, and human embryonic stem cells (collectively, human pluripotent stem cells, hPSCs) with dystrophin mutation introduced by CRISPR/Cas9 technology. Recent evidence suggests association of DMD development with progenitor population dysfunction or depletion. We have given proof of numerous functional abnormalities in the DMD patient hPSC derived CMs, but such phenotype fails to clarify the onset and development of the cardiac failure. Thus, we focused on studying DMD mutated progenitor stem cell populations. We observed presence and properties of resident cardiac stem cell (CSCs) in the heart of dystrophin mutation carrying patient undergoing transplantation, showing depletion and functional impairment of CSCs. We further used dystrophin-deficient mdx mouse model to confirm the CSCs depletion and observed association with increased DNA breaks in DMD CSCs pointing to DNA damage association with depletion of CSCs. The molecular basis of observed phenomena was further investigated in DMD hPSCs model. We proved that healthy hPSCs express dystrophin and observed that the absence of this protein in DMD hPSCs leads to dysregulation of all three isoforms of nitric oxide synthase (NOS) activity. This deregulation results in significantly elevated levels of reactive oxygen species (ROS) and oxidative DNA damage. The causal link between NOS, ROS and DNA damage was proven by NOS inhibition resulting in decrease of ROS levels and DNA damage. Furthermore, the DMD phenotype is associated with increased mutation frequency of the hPSCs, which suggests causal link leading from dystrophin deficiency via NOS dysregulation to the elevated ROS and subsequent DNA damage and mutagenesis. Our analysis demonstrated that the development of cardiac symptoms in DMD patients are correlated with accelerated depletion of CSCs, which show accumulation of DNA damage. This DNA damage was found to be associated with elevated ROS due to deregulated NOS activity caused by loss of dystropfin. Dystrophin deficiency-associated genomic damage at the pluripotent level and also on the level of CSCs provides of important information of a key role of dystrophin in hPSCs, but also other stem cells requiring genomic stability.

Keywords

Duchennova svalová dystrofie, DMD, pluripotentní kmenové buňky, kmenové buňky, ROS, NO syntáza, modelování chorob, kardiomyocyty, Duchenne muscular dystrophy, pluripotent stem cells, stem cells, NO synthase, disease model, cardiomyocytes

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 25. 2. 2019

Thesis defence

• Date of defence: 25. 3. 2019
• Supervisor: Mgr. Vladimír Rotrekl, Ph.D.
• Reader: doc. Lukáš Kubala, Dr. Gilles Carnac, PhD

Masaryk University

Faculty of Medicine

Doctoral programme / field:
Medical Biology (4-years) / Medical Biology