Nové regulační mechanismy ve Wnt dráze

Mgr. Marek Kravec, Ph.D.

Doctoral thesis

Novel regulatory mechanisms of Wnt signalling pathway

Abstract:

Wnt signální dráha je vysoce konzervovaná dráha, která má zásadní význam pro regulaci embryonálního vývoje, jakož i pro udržování homeostázy v dospělých organismech. Její deregulace je spojena s vývojovými poruchami a mnoha typy rakoviny. Protein Dishevelled (DVL) je klíčovým přenašečem signálu v signální dráze Wnt. Jeho hlavní úlohou je působit jako přepínač mezi různými následnými signalizačními událostmi. Protein DVL se skládá ze tří strukturovaných domén, avšak většina proteinu je nestrukturovaná, a proto jej můžeme zařadit do kategorie vnitřně neuspořádaných proteinů (IDP). Stejně jako většina IDP prochází četnými post-translačními modifikacemi (PTM) (1), které regulují jeho funkce. PTM vytvářejí různé varianty proteinů, které mají zásadní význam pro regulaci složitých biologických procesů, jako jsou signální dráhy, kde vzájemné ovlivňování mnoha interagujících partnerů vede k vyladěné buněčné odpovědi. Ukázali jsme, že enzym tubulin tyrosin ligase-like 11 (TTLL11), o němž je známo, že katalyzuje PTM polyglutamylaci, interaguje se všemi třemi lidskými homology DVL proteinu a zprostředkovává jejich reverzibilní polyglutamylaci. Dále jsme ukázali, že s DVL interagují také deglutamylační enzymy z rodiny cytosolových karboxypeptidáz (CCP), což vede k odstranění polyglutamátového řetězce. Pomocí zkrácených variant proteinu DVL s následnou analýzou pomocí WB nebo hmotnostní spektrometrie jsme lokalizovali místo polyglutamylace na C-konci DVL. Ukázali jsme, že tento typ PTM má nový charakter, který nebyl dosud pozorován u žádného jiného proteinu. Pomocí mutovaných variant C-konce DVL jsme analyzovali proces modifikace a ukázali jsme, že pro modifikaci je důležitý spíše negativní náboj C-konce než sekvenční motiv. Z funkčního hlediska jsme prokázali, že polyglutamylace moduluje interakci DVL s jeho klíčovými interakčními partnery a ovlivňuje tvorbu jeho biomolekulárních kondenzátů. Biomolekulární kondenzáty jsou buněčné kompartmenty bez membrán, které vznikají díky fázové separaci kapalina-kapalina poháněné intermolekulárními multivalentními interakcemi. V tomto kompartmentu je prostorově a časově obohacená koncentrace molekul umožňující energeticky méně příznivé interakce. Ukazuje se, že jsou zapojeny do různých signálních drah a jejich tvorba je silně ovlivněna PTM. Jejich regulace, složení a dynamika jsou však stále málo známé. Ukazujeme, že DVL kondenzáty vykazují fyzikální vlastnosti kapaliny a polyglutamylace ovlivňuje jejich dynamiku. Dále jsme analyzovali fosforylační profil DVL zprostředkovaný několika kinázami, které interagují s DVL. Následně jsme vyvinuli sadu specifických protilátek pro sledování těchto fosforylačních událostí DVL proteinu. Abychom mohli zkoumat mechanismy pozorované v buňkách s minimem komponent, vypurifikovali jsme rekombinantní DVL pro in vitro studie. Navíc jsme rekombinantní DVL použili ke studiu jeho interakce s plazmatickou membránou. Souhrnně lze říci, že výsledky prezentované v této práci komplexně popisují novou PTM proteinu DVL a ukazují některé její funkční důsledky. Pro analýzu složitých regulačních mechanismů proteinu DVL jsem navíc vyvinul několik nástrojů a analýz, které jsou uvedeny v této dizertační práci.

Abstract:

The Wnt signalling pathway is a highly conserved pathway crucial in the regulation of embryonic development as well as in the maintenance of homeostasis in adult organisms. Its deregulation is associated with developmental disorders and many types of cancer. Protein Dishevelled (DVL) is a key signal transducer within the Wnt signalling. The main role of DVL is to act as a switch between various downstream signalling events. DVL consists of three structured domains, but the major of the protein is unstructured, thus we can categorize it as an intrinsically disordered protein (IDP). Like most IDPs, it undergoes numerous post-translational modifications (PTMs) (1) that regulate its functions. PTMs form different protein variants, which are crucial in the regulation of complex biological processes such as signalling pathways, where crosstalk between numerous interacting partners results in a fine-tuned cellular response. We have shown that the enzyme tubulin tyrosine ligase-like 11 (TTLL11), which is known to catalyse PTM polyglutamylation, interacts with all three human homologues of protein DVL and mediates their reversible polyglutamylation. Moreover, we show that also deglutamylating enzymes from the cytosolic carboxypeptidase (CCP) protein family interact with DVL resulting in the removal of the polyglutamate chain. We have mapped the polyglutamylation modification site to the C-terminus of DVL by using truncated versions of DVL followed by WB analysis or mass spectrometry analysis. We show that this type of PTM has a novel character that has not been observed on any other protein before. We have analysed the modification process using mutated variants of the DVL C-terminus and we show that the negative charge of the C-terminus is important for modification rather than a sequence motif. From a functional point of view, we demonstrate, that polyglutamylation modulates the interaction of DVL with its key interacting partners and affects the formation of its biomolecular condensates. Biomolecular condensates are membrane-less cellular compartments that are formed through liquid-liquid phase separation driven by intermolecular multivalent interactions. This compartment has a spatiotemporally enriched concentration of molecules allowing less favourable interactions to happen. They are shown to be involved in various signalling pathways, and their formation is highly affected by PTMs. However, their regulation, composition and dynamics are still poorly understood. We show that DVL condensates exhibit the behaviour of liquid droplets and polyglutamylation affects their dynamics. Additionally, we have analysed the phosphorylation landscape of DVL mediated by several DVL- interacting kinases. Subsequently, we have developed a set of specific antibodies to monitor these phosphorylation events on DVL. For in vitro studies, we have purified recombinant DVL, which is a useful tool for dissecting mechanisms observed in cells with minimal components. Moreover, we used recombinant DVL to study its interaction with the plasma membrane. In summary, the results presented in this thesis comprehensively describe a new PTM of protein DVL and show some of its functional consequences. Moreover, I have developed several tools and assays that were used to analyse the complex regulatory mechanisms of DVL.

Keywords

signální dráha Wnt, Dishevelled, polyglutamylace, Tubulin tyrosine ligase-like (TTLL), Cytosolic carboxypeptidase (CCP), posttranslační modifikace, fosforylace, biomolerulární kondenzáty

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 6. 3. 2023

Thesis defence

• Date of defence: 24. 3. 2023
• Supervisor: prof. Mgr. Vítězslav Bryja, Ph.D.
• Reader: RNDr. Zdeněk Lánský, Ph.D., Dr. Steffen Scholpp

Masaryk University

Faculty of Science

Doctoral programme / field:
Animal physiology, immunology and developmental biology / Animal physiology, immunology and developmental biology