Elektrochemická oxidace flavonolignanů a flavonolů a jejich biotransformace in vitro

Mgr. Martina ZATLOUKALOVÁ

Doctoral thesis

Electrochemical Oxidation of Flavonolignans and Flavonols and their Biotransformation In Vitro

Abstract:

Disertační práce se zabývá studiem elektrochemické oxidace vybraných flavono- lignanů, jejich interakcí s deoxyribonukleovými kyselinami a proteiny a biotransformací nově připravených galloyl derivátů kvercetinu a taxifolinu na lidských hepatocytech. Byly studovány antioxidační a prooxidační vlastnosti flavonolignanů silybinu, jeho methylovaných derivátů, 2,3-dehydrosilybinu a gallátů silybinu. Z dalších flavonoidů kvercetin, rutin, isokvercitrin a taxifolin. Oxidace polyfenolů byla studována pomocí ex situ a in situ cyklické voltametrie, diferenční pulzní voltametrie a voltametrie s vkládaným pravoúhlým napětím na elektrodě z pyrolytického grafitu a skelného uhlíku. Oxidace probíhá vícekrokově a je závislá na pH prostředí. Flavonolignany a jejich deriváty reagují nekovalentní interakcí s deoxyribonukleovými kyselinami (DNA) na rozdíl od jejich reaktivních komplexů s ionty přechodných kovů, které mohou poškozovat DNA tvorbou aduktů nebo sekundární produkcí volných radikálů. V přítomnosti volných radikálů dochází k oxidativnímu poškození DNA a k fragmentaci molekuly DNA. Fragmentace DNA byla studována pomocí gelové elektroforézy a pro purifikaci poškozené DNA bylo využito magnetoseparačních technik. Získané výsledky přinesly nové poznatky o reaktivitě, stabilitě, antiradikálových resp. antioxidačních a prooxidačních vlastnostech flavonoidů, a charakteru jejich interakce s biomakromolekulami. Flavonolignany působily jako antioxidanty nejen v roztoku, ale také po vazbě na membrány erytrocytů. Interakce mezi flavonolignany a erytrocyty byla zkoumána pomocí ex situ voltametrie s vkládaným pravoúhlým napětím na elektrodě z pyrolytického grafitu. Na základě dosažených výsledků lze předpokládat, že flavonolignany interagují s membránami erytrocytů. Další část disertační práce je zaměřena na identifikaci biotransformačních produktů flavonoidů 3-O-galloylkvercetinu a 7-O-galloyltaxifolinu na izolovaných lidských hepatocytech. Toxicita 3-O-galloylkvercetinu a 7-O-galloyltaxifolinu byla nejprve ověřena na myších fibroblastech a lidských hepatocytech. Pomocí hmotnostní spektrometrie bylo zjištěno, že 3-O-galloylkvercetin se metabolizuje přímo na glukuronidy a methyl deriváty na rozdíl od 7-O-galloyltaxifolinu, který se může oxidovat na galloylkvercetin, nebo štěpit na taxifolin a kyselinu gallovou s následnou glukuronidací a/nebo sulfatací. Biotransformace obou látek je doprovázena štěpením esterové vazby buněčnými enzymy. Výsledky poskytují základní pohled na biotransformaci esterů flavonoidů a mohou být použity při detailnějším studiu farmakologického potenciálu nově připravených polyfenolových látek.

Abstract:

This dissertation thesis focuses on in vitro studies of flavonoids, their interactions with deoxyribonucleic acids (DNA) and proteins, and an analysis of the biotransformation of flavonoids by newly developed methods, especially electrochemical and mass spectrometric approaches. First, the antioxidant and prooxidant properties of flavonolignans (silybin and its methyl-derivatives, 2,3-dehydrosilybin and silybin galloyl esters) and selected flavonols were studied by voltammetric and electrophoretic methods. The oxidation of the compounds is a pH-dependent and multistep reaction, which was studied using ex situ/in situ cyclic voltammetry, differential pulse voltammetry and square wave voltammetry at pyrolytic graphite and glassy carbon electrodes. Flavonolignans and their derivatives exhibit only weak non-covalent interactions with DNA in contrast to flavonolignan/metal complexes that induce DNA damage via the formation of adducts and generation of free radicals. Magnetoseparation techniques were used for the isolation and purification of DNA fragments and adducts. The results presented here provide new evidence on the reactivity, stability, antioxidant and prooxidant properties of flavonoids and their ability to interact with DNA, proteins, lipids and other biomacromolecular systems. Flavonolignans act as antioxidants, not only in solution but also after binding to erythrocyte membranes. Interactions between silymarin (or pure silybin) and erythrocytes were examined by ex situ square wave voltammetry using a pyrolytic graphite electrode. Based on these results, we assume that flavonolignans interact with the membranes of erythrocytes where they could modulate the redox balance in erythrocytes. The next part of this thesis is focused on identifying the biotransformation products of the semisyntheticaly prepared flavonoids 3-O-galloylquercetin and 7-O-galloyltaxifolin using isolated human hepatocytes. Prior to biotransformation analysis, the cytotoxic effects of flavonoids were examined using MTT assay in mouse fibroblasts and human hepatocytes. Using mass spectrometry analysis, it was found that 3-O-galloylquercetin is transformed directly into glucuronides and methyl derivatives, in contrast to 7-O-galloyltaxifolin, which could be oxidized to galloylqercetin or deconjugated into taxifolin and gallic acid, followed by glucuronidation or sulfation. The biotransformation of both substances is accompanied by the cleavage of ester linkages by cellular enzymes. The results presented here provide a basic overview of the biotransformation of flavonoid esters and could be used in further studies on the pharmacological potential of newly designed polyphenols.

Keywords

flavonolignany, flavonoly, elektrochemická analýza, antioxidační aktivita, DNA interakce, erytrocyty, biotransformace

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 16. 2. 2015

Accessible from:: 16. 2. 2015

Thesis defence

• Date of defence: 20. 4. 2015

PALACKÝ UNIVERSITY IN OLOMOUC

Faculty of Medicine and Dentistry

Doctoral programme / field:
Medical Chemistry and Biochemistry / Medical Chemistry and Biochemistry