Molekulová dynamika cyklin-dependentních protein kinas

Mgr. Iveta Bártová, Ph.D.

Doctoral thesis

Molecular dynamics on cyclin-dependent kinases

Abstract:

Cyklin-dependentní kinasy (CDK) (EC 2.7.1.37) přísluší do katalytické podjednotky heterodimerních serin/threonin protein kinas (patří zde např. CDK1, CDK2, CDK4), které jsou v eukaryotických buňkách důležité pro regulaci mnoha kritických biologických procesů. Role CDK5, jenž náleží také mezi CDK enzymy, je rovněž nebuněčná. CDK5 se nachází v post-mitotických buňkách centrálního nervového systému a je vyžadována během nervového dělení. Z důvodu, že deregulace CDK byla prokázána v řadě nádorů, patří tyto enzymy v lékařství mezi slibné biologické terče pro návrh nových inhibitorů. CDK inihibitory jsou testovány pro léčbu mnoha závažných onemocnění, mezi které patří např. rakovina, neurodegenerativní poruchy (např. Alzheimerova choroba, amyotrofní laterální skleróza, mrtvice), cukrovka, kardiovaskulární poruchy (např. arterioskleróza, restenóza), virové nákazy (např. HCMV, HIV, HSV) atd. Disertační práce byla zaměřena na studium cyklin-dependentní kinasy-2 (CDK2) a cyklin-dependentní kinasy-5 (CDK5), kdy v jejím průběhu byla s pomocí počítačových metod popsána struktura, dynamika, vazba a interakce ligandů k CDK, hydratace a molekulové interakce CDK. Aktivita těchto enzymů je kontrolována reverzibilní fosforylací, syntézou a degradací aktivačních a inhibičních podjednotek. Speciální pozornost byla proto také věnována studiu aktivace a inhibice CDK fosforylací a interakcím CDK s jejich regulačními podjednotkami (např. cyclin A je jedním z proteinů, který aktivuje CDK2 a p25, který patří mezi regulační podjednotky proteinu CDK5). Fosforylace proteinů v eukaryotech patří mezi nejdůležitější funkce regulace buňky, kdy enzymy jsou aktivovány a deaktivovány fosforylací a defosforylací. Pro pochopení deregulace a původu závažných nemocí je důležité porozumění mechanismu regulace buněčného cyklu. Proto je dalším přínosem této disertační práce vysvětlení rozdílných regulačních mechanismů CDK2 a CDK5. Analýza hydratace aktivního místa CDK2 byla použita pro návrh nových inhibitorů. Byly připraveny molekulové dynamické simulace CDK2 s ATP, který je přirozeným substrátem CDK, a simulace komplexů CDK2 s roskovitinem a isopentenyladeninem, které patří mezi purinové inhibitory CDK. S využitím těchto simulací bylo nalezeno několik molekul vod, které se vyskytovaly v kontaktu s proteinem po celou dobu simulace. Pozice nalezených stabilních molekul vod byly porovnány s pozicí polárních skupin ligandů a pozicí molekul vod získaných RTG analýzou. Touto analýzou byly nalezeny stabilní molekuly vod ve volné CDK2, které zaujímají stejné vazebné místo jako polární skupiny sledovaných ligandů. Chování molekul vod interagujících s aminokyselinami v aktivním místě enzymu, jejich interakční energie a informace o vazebném místě poskytují cenné výsledky, které mohou být využity pro návrh a vývoj selektivních inhibitorů. Pomocí molekulové dynamiky bylo na nanosekundové časové škále sledováno několik různě aktivních forem CDK2 (neaktivní, částečně aktivní, aktivní a inhibované formy proteinu) a CDK2 (aktivní a inhibované formy) v komplexu se substrátem HHASPRK. Detailně byl studován mechanismus inhibice CDK2 po fosforylaci na inhibičních místech proteinu v glycinové smyčce (G-smyčce). Výsledky studia inhibice CDK2 pomocí fosforylace na inhibičních místech proteinu poskytují dříve neznámé strukturní detaily deaktivace tohoto proteinu. Katalytickou funkcí CDK je přenos g-fosfátové skupiny z ATP (ATP je vázáno v komplexu s Mg2+ kationtem) k serinu, případně threoninu cílových proteinů. Z tohoto důvodu je pro přenos koncové fosfátové skupiny z ATP k substrátu CDK2 důležitá správná koordinace Mg2+ iontu a vhodná konformace a orientace koncové fosfátové sk

Abstract:

upiny ATP. Pozice a orientace g-fosfátové skupiny ATP vzhledem k serinu, fosforylačnímu místu substrátu HHASPRK, byla sledována v aktivní CDK2 a porovnána k jejímu umístění a orientaci, kterou získala po inhibiční fosforylaci CDK2. Inhibiční fosforylace způsobila změnu konformace a orientace ATP, která byla vhodná pro přenos fosfátové skupiny. Zároveň dochází také ke změně koordinační sféry Mg2+ iontu a odklonu inhibičního segmentu (G-smyčky), což způsobilo otevření vazebného boxu pro substrát a tím vedlo k destabilizaci substrátu. Všechny výše zmíněné efekty jasně vysvětlují ztrátu aktivity enzymu po inhibiční fosforylaci v G-smyčce. S využitím počítačových simulací byly také sledovány interakce specifických residuí pro vazbu substrátu HHASPRK k CDK2, které objasnily dříve neznámý fakt, proč je v pozici P2 substrátu preferované bazické residuum (R/K). R2 residuum interaguje s fosfátovou částí ATP, což může hrát důležitou roli v reorientaci ATP do pozice, která je vhodná pro katalytickou reakci. Dále byla studována dynamika enzymu CDK5 a komplexu CDK5 s roskovitinem a mechanismus jeho aktivace a inhibice fosforylací. Dosažené výsledky byly porovnány s mechanismem regulace CDK2. K detailnímu popisu interakčních energií roskovitinu k CDK5 (u nefosforylované a fosforylované formy CDK5 v G-smyčce) byla použita metoda energetické dekompoziční analýzy. Pro srovnání byla tato metoda také použita u komplexů CDK2. Stejný přístup byl využit k nalezení regionů proteinu s nejvyššími energetickými příspěvky k interakční energii mezi CDK5 a p25 a také mezi CDK2 a cyklinem A. Použitá metoda ukázala, že vazba p25 k CDK5 je dostačující pro stabilizaci aktivní konformace T-smyčky v CDK5, zatímco interakce cyklinu A k CDK2 není schopna CDK2 plně aktivovat. Tento enzym dále pro svou aktivaci požaduje fosforylaci T160 v aktivačním segmentu (T-smyčce). Rozdíly mezi oběma studovanými systémy, preference CDK5 pro p25 a CDK2 pro cyklin A a jejich regulační mechanismy byly podrobně zkoumány a diskutovány s ohledem k jejich specifické biologické funkci.

Abstract:

The cyclin-dependent kinases (CDKs) (EC 2.7.1.37) are the catalytic subunits of a large family of heterodimeric serine/threonine protein kinases, which are important for regulation of many biologically critical processes in eukaryotic cell (for example CDK1, CDK2, CDK4). CDK5, one of CDK family members having also the non-cell-cycle role, is expressed in post-mitotic cells of the central nervous system and is required during neuronal differentiation. Therefore, CDKs belong to promising biological targets in human medicine for design new inhibitors due to observation of their deregulation in series cancer. CDKs inhibitors are tested for treatment of many serious human diseases e.g., cancer, neurodegenerative disorders (e.g. Alzheimers disease, amyotrophic lateral sclerosis and stroke), diabetes, cardiovascular disorders (e.g. atherosclerosis and restenosis), viral infections (e.g. HCMV, HIV and HSV) etc. The presented PhD thesis is focused on study of cyclin-dependent kinase 2 (CDK2) and cyclin-dependent kinase 5 (CDK5) and describes structure, dynamics, ligand binding and interaction, hydration, and molecular interactions of CDKs with using computational techniques. The activity of these enzymes is controlled by reversible protein phosphorylation and synthesis and degradation of activator and inhibitor subunits. Consequently, a special attention is paid to the activation and inhibition of CDKs by phosphorylation and interaction of CDKs with regulatory subunits. In eukaryotes, protein phosphorylation is probably the most important regulatory event. Many enzymes are switched on or off by phosphorylation and dephosphorylation. The insight of mechanism of cell cycle regulation is important for understanding deregulation and origin of relevant diseases. Analysis of the CDK2 active site hydration was used as a method for design new inhibitors. The molecular dynamics (MD) simulations of the CDK2/ATP (native substrate of CDK2) complex and CDK2 in the complex with roscovitine and isopentenyladenine (purine-like inhibitors of CDK) were studied. A number of water molecules that were in contact with the protein for the whole trajectory were assigned. The positions of structural water molecules were compared with the positions of ligand polar groups and water molecules found by X-ray analysis. The structural water molecules in the free CDK2, which occupy the same binding sites as polar groups of ligand molecules, were found. The behavior of water molecules interacting with amino acids in the enzyme active site, their interaction energies, and location, provides information that is useful for the rational drug design of new potent and selective inhibitors. Nanoseconds long MD trajectories of differently active complexes of human CDK2 (inactive, semiactive, fully active, and inhibited CDK2) and CDK2 (fully active and inhibited form) in complex with peptide substrate HHASPRK were produced. The mechanism of the CDK2 inhibition by phosphorylation on inhibitory sites in the glycine-rich loop (G-loop) was studied in detail. The MD simulations results of CDK2 inhibition by phosphorylation on inhibitory sites provide insight into the structural aspects of CDK2 deactivation. The catalytic function of CDKs is the covalent phosphorylation of substrate protein via transfer of the g-phosphoryl group of ATP to threonine or serine of the target protein substrate. Therefore, the correct coordination of the Mg2+ ion and appropriate conformation and orientation of the ATP phosphate group are important for ATP terminal phospho-group transfer to the CDK2 substrate. The position of the ATP g-phosphate relative to the phosphorylation site of the peptide substrate in the active CDK2 was described and compared with inhibited forms of CDK2. The inhibitory phosphorylation causes ATP misalignment for phosphorylation, changes in the Mg2+ ion coordination sphere, and G-loop conformational change, which leads to the opening of the CDK2 substrate binding box and substrat

Abstract:

e destabilization. All mentioned effects explain the lost of kinase activity after inhibitory phosphorylation in the G-loop. The interactions of the specific residues for substrate HHASPRK binding to CDK2 were studied with MD simulations. The results clearly provided an explanation previously not known as to why a basic residue (R/K) is preferred at the P2 peptide substrate position. The R2 interacts with the ATP phosphate moiety and, therefore, it can play a role in appropriate ATP alignment before the reaction. The dynamics and mechanisms of activation and inhibition by phosphorylation of CDK5 and CDK5/roscovitine were studied and compared to CDK2 regulation. Energy decomposition analysis was used to gain a detailed interaction scheme for roscovitine with CDK5 (unphosphorylated and phosphorylated CDK5) and also for CDK2 for comparison. The same method was also used to determine regions with the highest energy contributions to the interaction energy between CDK5 and p25, and, also between CDK2 and cyclin A and revealed that p25 binding is sufficient to stabilize the extended active T-loop conformation of CDK5, while cyclin A binding to CDK2 is not able to gain a biologically fully active system, this needing further phosphorylation of the T160 in the activation segment (T-loop). Differences between studied systems, preference of CDK5 for p25 and CDK2 for cyclin A, and their different mechanisms of regulation, were investigated and discussed with respect to their specific biological function.

Keywords

CDK regulace, fosforylace, molekulová dynamika, buněčný cyklus, CKD regulation, phosphorylation, molecular dynamics, cell cycle

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 10. 4. 2006

Thesis defence

• Date of defence: 10. 4. 2006
• Supervisor: prof. RNDr. Jaroslav Koča, DrSc.

Masaryk University

Faculty of Science

Doctoral programme / field:
Biochemistry / Biomolecular Chemistry