Termodynamická analýza DNA po její modifikaci protinádorově účinnými látkami

Mgr. Vendula Bursová, Ph.D.

Doctoral thesis

Thermodynamic analysis of DNA modified by antitumor drugs

Abstract:

ABSTRAKT K léčbě některých typů nádorů se již řadu let s úspěchem využívá léčiv s centrálním kovovým iontem. Nejdéle používaným cytostatikem s centrálním Pt(II) iontem je cisplatina (cis-diaminodichloroplatnatý komplex). Platinové a taktéž rutheniové komplexy reagují v buňce s molekulami DNA. Modifikace DNA těmito komplexy a následné buněčné procesy jsou pravděpodobně příčinou jejich protinádorového účinku. Pro pochopení mechanismu účinku platinových a rutheniových komplexů je třeba důkladně analyzovat změny biofyzikálních parametrů a struktury DNA vlivem jejich vazby a jejich korelaci s následnými buněčnými procesy. Jednou z moderních metod používaných pro měření biofyzikálních parametrů DNA je mikrokalorimetrie. Metodou diferenční skenovací kalorimetrie byly studovány termodynamické parametry monofunkčních aduktů klinicky neúčinných komplexů dienplatiny a komplexu [PtCl(NH3)3]Cl. Jedním z buněčných mechanizmů odstraňujících léze na DNA způsobené vazbou komplexů je nukleotidová excizní oprava. Experimentálně bylo ukázáno, že monofunkční adukty dienplatiny a komplexu [PtCl(NH3)3]Cl nejsou na rozdíl od vnitrořetězcového můstku cisplatiny tímto buněčným mechanismem odstraňovány. Z naměřených výsledků je zřejmé, že oprava nukleotidovým excizním opravným systémem je indukována spíše termodynamickou než termální destabilizací DNA. Při vývoji nových cytostatik bylo objeveno několik protinádorově účinných komplexů odvozených od klinicky neúčinné transplatiny (trans-diaminodichloroplatnatý komplex), které se na rozdíl od cisplatiny váží převážně monofunkčně. Pro měření termodynamických parametrů DNA nesoucí monofunkční adukty komplexů odvozených od transplatiny (trans-EE, trans-thiazolový komplex) bylo využito izotermální titrační kalorimetrie. Změny termodynamických parametrů způsobené vznikem monofunkční vazby těchto komplexů jsou v dobré shodě se vzniklými konformačními změnami DNA a následnými buněčnými procesy, jako je opravna nukleotidovým excizním reparačním systémem či zastavení DNA polymerázy. Izotermální titrační kalorimetrie bylo využito také pro měření termodynamických parametrů DNA nesoucí monofunkční adukty Ru(II)arenových komplexů. Monofunkční adukt komplexu Ru-CYM, jehož vazba na DNA nemůže zahrnovat interkalaci, více termodynamicky destabilizuje DNA a je také účinněji odstraňován nukleotidovým excizním reparačním systémem, než je tomu v případě monofunkčního aduktu komplexu Ru-THA, jehož vazba na DNA interkalaci zahrnovat může.

Abstract:

ABSTRACT Complexes with central metal ions are used as drugs for the treatment of several types of human carcinomas. Cisplatin (cis-diamminedichloro-platinum(II)) is the most utilized antitumor platinum drug. Platinum and also ruthenium complexes are able to form on DNA various types of adducts. Their interaction with DNA and consequent downstream effects in cells are probably very important for their antitumor efficacy. It is important to analyze changes of biophysical and structural parameters of DNA caused by covalent binding of platinum and ruthenium complexes and correlate them with consequent downstream effects in cells to understand the mechanism of their antitumor efficacy. Microcalorimetry is a modern method used for measuring biophysical parameters of DNA. Differential scanning calorimetry was employed to characterize the influence of monofunctional adducts of clinically ineffective complexes PtCl(dien)]Cl and [PtCl(NH3)3]Cl on the thermal stability and energetics of DNA duplexes. Nucleotide excision repair (NER) is one of the cell mechanisms removing adducts of platinum complexes from DNA. We have experimentally demonstrated that monofunctional adducts of complexes PtCl(dien)]Cl and [PtCl(NH3)3]Cl are not removed from DNA by mammalian excinucleases. The results of the present work represent a direct experimental support for the view that rather thermodynamic than thermal characterization of DNA lesions is a property implicated in the modulation of downstream effects such as protein recognition and repair. Recently, several antitumor active derivates of the clinically ineffective transplatin (trans-diamminedichloroplatinum(II)), which form on DNA preferentially monofunctional adducts, were found. For measuring thermodynamic parameters of DNA modified by the complexes trans-[PtCl2(NH3)(thiazole)] and trans-[PtCl2(E-iminoether)2] isothermal titration calorimetry was employed. Changes in thermodynamical parameters and DNA structure caused by monofunctional binding of these two complexes correlate well with subsequent downstream effects such as DNA repair by NER. Izothermal titration calorimetry was also employed to characterize the influence of monofunctional adducts of Ru(II)-arene complexes on the thermal stability and energetics of DNA duplexes. DNA modified by the complex Ru-THA, that may interact with DNA by intercalation was thermodynamically destabilized considerably less than in the case of the complex Ru-CYM, which cannot interact with DNA by intercalation. Monofunctional adduct of the complex Ru-CYM was also removed from DNA more efficiently than monofunctional adduct of Ru-THA.

Keywords

protinádorové komplexy platiny, cisplatina, DNA, DSC, ITC

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 16. 11. 2007

Thesis defence

• Date of defence: 16. 11. 2007
• Supervisor: prof. RNDr. Viktor Brabec, DrSc.
• Reader: prof. RNDr. Michaela Wimmerová, Ph.D., Mgr. Olga Nováková, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Science

Doctoral programme / field:
Physics (4-years) / Biophysics