Chemická derivatizace histonových proteoforem pro hmotnostně spektrometrickou analýzu

Mgr. Palina Ryzhaya

Diplomová práce

Chemical derivatization of histone proteoforms for mass spectrometric analysis

Anotace:

Posttranslační modifikace histonů jsou epigenetické značky spojené s regulací klíčových buněčných procesů, jako je transkripce, replikace a oprava DNA. Provádění kvalitativní a kvantitativní analýzy histonových proteoforem je zásadní pro pochopení mechanismů normálních a patologických procesů, protože jejich regulace zahrnuje změny ve struktuře a dynamice chromatinu. Hmotnostní spektrometrie je v současnosti nejrozšířenějším přístupem pro analýzu histonů. Navzdory vysoké přesnosti a citlivosti se histonová analýza pomocí LC-MS/MS stále potýká s problémy, z nichž mnohé souvisí s častou přítomností zbytků lysinu a argininu v aminokyselinových sekvencích histonů. Ačkoli chemická derivatizace amino skupin byla zavedena jako užitečná strategie pro přípravu histonových vzorků pro proteomiku z dola, nevýhody spojené se značením aktuálně používanými anhydridy omezují výsledky histonových analýz založených na hmotnostní spektrometrii. V této diplomové práci bylo testováno několik anhydridů jako alternativních derivatizačních činidel k překonání nevýhod běžně používaného anhydridu kyseliny propionové. MALDI-TOF hmotnostní spektrometrie byla použita k výběru potenciálních kandidátů pro následné upřesnění podmínek značení, včetně koncentrace anhydridu a parametrů inkubace. Po určení anhydridu kyseliny trifluoropropionové jako nejslibnějšího al-ternativního derivatizačního činidla byla vyhodnocena účinnost a porovnána s deri-vatizací anhydridu kyseliny propionové. Získaný protokol prozatím neumožňuje jeho použití jako alternativu ke stávajícím metodám z důvodu výrazně nižší účinnosti značení. Pokud se v budoucnu podaří protokol vylepšit, může se stát anhydrid kyseliny trifluoropropionové vzhledem k velkému zvýšení hydrofobicity peptidů a absenci nespecifických reakcí slibnou alternativou pro derivatizaci histonů.

Abstract:

Histone post-translational modifications are epigenetic marks associated with the regulation of key cellular processes such as transcription, replication, and DNA repair. Conducting quali-tative and quantitative analysis of histone proteoforms is crucial for understanding the mech-anisms of normal and pathological processes, as their regulation involves changes in chroma-tin structure and dynamics. Mass spectrometry is currently the most widely used approach for histone analysis. Despite its high accuracy and performance, histone analysis by LC-MS/MS still faces challenges, many of which are related to the frequent presence of lysine and arginine residues in histone amino acid sequences. Although chemical derivatization of amine groups has been introduced as a useful strategy to prepare histone samples for bottom-up prote-omics, drawbacks associated with labelling with currently used anhydrides limit the outcome of mass spectrometry-based histone analyses. In this thesis, several anhydrides were tested as alternative derivatization agents to overcome the drawbacks of commonly used propionic anhydride. MALDI-TOF mass spec-trometry was used to select potential candidates for subsequent refinement of the labelling conditions, including anhydride concentration and incubation parameters. After determining trifluoropropionic anhydride as the most promising alternative derivatization agent, the per-formance was evaluated and compared with propionic anhydride derivatization. The protocol obtained does not yet allow its use as an alternative to existing methods because of signifi-cantly lower labelling efficiency. When improved, trifluoropropionic anhydride can be a prom-ising candidate for histone derivatization because of the large increase in peptides’ hydropho-bicity and the absence of non-specific reactions.

Keywords

Histony, posttranslační modifikace, chemická derivatizace, hmotnostní spektrometrie, histones, post-translational modifications, chemical derivatization, mass spectrometry

Jazyk práce: angličtina

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 4. 1. 2024

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 12. 2. 2024
• Vedoucí: Mgr. Gabriela Lochmanová, Ph.D.
• Oponent: Mgr. Petr Lapčík, Ph.D.

Masarykova univerzita

Přírodovědecká fakulta

Magisterský studijní program / obor:
Biochemie / Biomolekulární chemie