Charakteristika fosfomimikujících mutantů 14-3-3zeta proteinu.

Bc. Alexandra Náplavová

Bachelor's thesis

Characterization of phospho-mimicking mutants of 14-3-3zeta protein.

Abstract:

14-3-3 proteiny jsou eukaryotické regulační proteiny zapojené do široké řady buněčných procesů, jako buněčná smrt či regulace buněčného cyklu. Klíčovým faktorem pro jejich funkci je jejich dimerní charakter. Ten může ovlivnit fosforylace 14-3-3ζ na Ser58, která byla pozorována in vivo. Příprava fosforylovaného proteinu je ovšem problematická, v praxi se tedy využívá fosfomimikujících mutantů S58E a S58D. Jejich charakteristika v literatuře je nicméně nejednoznačná. V této bakalářské práci byly proto podrobeny rozsáhlé charakterizaci a byl uveden nový dvojitý mutant S57D S58D. Poprvé bylo také provedeno přímé srovnání s fosforylovaným proteinem. Výsledky ukázaly, že žádný z fosfomimikujících mutantů není dostačující alternativou fosforylovaného proteinu, vzhledem k rozdílům v termodynamických vlastnostech a oligomerní struktuře. Rovněž byl navržen nový přístup k přípravě fosforylovaného 14-3-3ζ a to ve formě chimerního konstruktu PKA-14-3-3ζ.

Abstract:

14-3-3 proteins are eukaryotic regulatory proteins involved in range of cellular processes, like cell death or cell cycle control. A dimeric character is crucial for their function. It was observed that phosphorylation of 14-3-3ζ at Ser58 influences the oligomeric state in vivo. However, the preparation of phosphorylated protein is problematic, leading to the introduction of phosphomimicking mutants S58E and S58D. Yet, their characterization in studies is unclear. Therefore, in this thesis both of the phosphomimicking mutants are thoroughly investigated and a novel double mutant S57D S58D is introduced. Furthermore, direct comparison with phosphorylated protein is performed for the first time. The results showed, that neither of the phosphomimicking mutants completely mimics the effect of phosphorylation, due to differences in thermodynamic properties and oligomeric nature. Moreover, a new approach towards preparation of phosphorylated 14-3-3ζ was designed in form of PKA-14-3-3ζ chimeric construct.

Keywords

14-3-3, fosfomimikující mutant, 14-3-3 fosforylace, fosforylace Ser58, monomerizace, phosphomimicking mutant, 14-3-3 phosphorylation, Ser58 phosphorylation, monomerization

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 15. 6. 2021

Thesis defence

• Date of defence: 28. 6. 2021
• Supervisor: RNDr. Mgr. Jozef Hritz, Ph.D.
• Reader: Mgr. Filip Melicher

Masaryk University

Faculty of Science

Bachelor programme / field:
Chemistry / Biophysical Chemistry