Identifikace rostlinných jaderných proteinů získaných precipitací MnCl2 pomocí hmotnostní spektrometrie

Bc. Zdeněk PERUTKA

Master's thesis

Identification of nuclear proteins of plant obtained by precipitation MnCl2 using mass spectrometry

Abstract:

Jádro je základní složkou eukaryotických buněk, jehož hlavní funkcí je uchovávat genetický materiál. Jádro obsahuje mnoho buněčných tělísek a struktur zapojených do metabolismu nukleových kyselin. V jádře se možná nachází také téměř čtvrtina všech buněčných proteinů. Hlavní funkcí těchto proteinů je regulace metabolismu nukleových kyselin. Nejvíce jaderných proteinů tvoří transkripční faktory a regulátory. Cílem této práce bylo otestovat metodu izolace jaderných proteinů v komplexech s nukleovými kyselinami z rostlinného extraktu srážením pomocí manganatých iontů. K tomuto účelu byly použity vypěstované týdenní etiolované semenáčky hrachu (Pisum sativum) a čtrnáctidenní etiolované rostlinky ovsa (Avena sativa). Izolované proteiny byly podrobeny enzymovému štěpení v gelu a vzniklé peptidy byly identifikovány po separaci kapalinovou chromatografií pomocí tandemové hmotnostní spektrometrie MALDI TOF-TOF MS/MS a ESI Q/TOF MS/MS. Identifikované proteiny byly rozřazeny do příbuzných skupin softwarovými nástroji genové ontologie. V extraktu z ovsa byly identifikovány pouze proteinové podjednotky hojně se vyskytující ribulosa-1,5-bisfosfát karboxylasy/oxigenasy. V extraktech z hrachu bylo identifikováno 288 proteinů, z nichž více než 25,4 % mohlo být lokalizováno přímo v jádře. Identifikováno bylo mnoho nukleoproteinů a proteinů vázajících nukleotidy. Metodou srážení extraktu Mn2+ je tedy možné získat precipitát obohacený o jaderné proteiny. Rostlinný materiál ovsa byl dále využit k izolaci polyaminoxidasy s cílem charakterizovat její glykosylaci.

Abstract:

The nucleus is essentials component of eukaryotic cells. The main function the nucleus is to store genetic material. Cell nuclei contain many nuclear bodies and structures involved in nucleic acids metabolism. About 25 % of the total cellular proteins are predicted to be localized in the nucleus. Nuclear proteins play key roles in the fundamental regulation of genome. Most numerous group of nuclear proteins are transcription factors.The aim of this work was to test the method for isolating the nuclear proteins in complexes with nucleic acids from a plant extract, by precipitation by means manganese(II) ions. Fourteen days old plants of oats and a week-old plants of pea grown in the dark were used for this experiment. The isolated proteins were subjected to enzymatic in-gel digestion, The isolated proteins were subjected to enzymatic digestion in the gel, and the obtained peptides were separated by liquid chromatography. The isolated peptides were identified by MALDI TOF-TOF MS / MS and ESI Q / TOF MS / MS. Using a software tools for gene ontology, the identified proteins were divided into groups according to their location, function and participation in biological processes. Only protein subunits of abundant ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxigenase were identified in the oats extract. 288 proteins were identified in extracts from pea and over 25.4% of them could be located in the nucleus. Many nucleoproteins and nucleotide-binding proteins were identified. Precipitation method using Mn(II) ions can be used to obtain a precipitate enriched with the nuclear proteins. Oat plant material was further used for the isolation of polyamine oxidase for order to characterize its glycosylation.

Keywords

jaderné proteiny, nukleové kyseliny, hmotnostní spektrometrie, polyaminoxidasa

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 20. 7. 2015

Accessible from:: 20. 7. 2015

Thesis defence

• Supervisor: prof. Mgr. Marek Šebela, Dr.

PALACKÝ UNIVERSITY OLOMOUC

Faculty of Science

Master programme / field:
Biochemistry / Biochemistry