Příprava a testování molekulárních nástrojů pro stadium funkce a lokalizace lidských demetyláz RNA.

Bc. Martin Hamřík

Bachelor's thesis

Preparation and validation of molecular tools for investigating function and localization of human RNA demethylases.

Abstract:

Pestrý svět epitranskriptomu je předmětem zájmu mnoha vědců, neboť skrze více jak 300 chemických modifikací RNA promlouvá do regulací genové exprese, buněčného cyklu, diferenciace a dalších buněčných pochodů. Nejčastější interní modifikací na mRNA je N6-metyladenozin (zkráceně m6A), který je na transkripty deponován skrze metyltransferázový komplex a zpětně odstraňován dvěma demetylázami – Fat mass and obesity-associated protein (FTO) a AlkB homolog 5 (ALKBH5). M6A zasahuje svým polem působení do naprosté většiny úrovní tvorby a funkce mRNA, čímž nedílně ovlivňuje základní buněčné procesy. Poruchy fungování aktérů m6A dráhy způsobuje řadu nemocí, včetně rakoviny. Snaha studovat m6A dráhu má proto význam v hlubšímu pochopení života buňky a možnosti zvrátit její patologické stavy. V této bakalářské práci byly vyvinuty nástroje umožňující detailnější studium demetyláz FTO a ALKBH5, ve kterých hraje centrální roli červený fluorofor mCherry. Jedná se o konstrukty exprimující transgenní proteiny mCherry-FTO a mCherry-ALKBH5, stabilní buněčné linie a jednodoménovou protilátku (nanobody) proti mCherry. Ve druhé části byla funkčnost připravených nástrojů testována na konfokálním mikroskopu a v imunoprecipitačních experimentech, které následně budou optimalizovány pro funkční studie v buňce.

Abstract:

A diverse world of epitranscriptome is the point of interest for many scientists, since it affects gene expression regulation, cell cycle, differentiation and other cell processes through more than 300 RNA chemical modifications. The most common internal one acting on mRNA is N6-metyladenosine (m6A for short), deponed by metyltransferase complex and erased by two demethylases – Fat mass and obesity-associated protein (FTO) and AlkB homolog 5 (ALKBH5). By its sope, m6A modulates the major part of mRNA creation and function, essentialy affecting fundamental cell processes. Aberant functions of m6A pathway actors results in several diseases, including cancer. Efforts in m6A pathway studies are therefore relevant to broaden the cell life knowledge and set back patological conditions. In this bachelor thesis, molecular tools for more detailed study of demethylases FTO and ALKBH5 were developed, with central role of red fluoro-phore mCherry. These tools encompass constructs expriming transgene proteins mCherry-FTO and mCherry-ALKBH5, stable cell lines and single domain antibody (nano-body) against mCherry. In the second part, the functionality of prepared tools was tested on confocal microscope and in immunoprecipitation experiments, which are going to be optimilized for functional study in the cell.

Keywords

modifikace RNA, N6\-metyladenozin, demetylázy, FTO, ALKBH5, mCherry, molekulární nástroje

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 19. 5. 2022

Thesis defence

• Date of defence: 20. 6. 2022
• Supervisor: prof. Mgr. Štěpánka Vaňáčová, Ph.D.
• Reader: Mgr. Marek Šebesta, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Science

Bachelor programme / field:
Biochemistry / Applied biochemistry