Separace a frakcionace komplexních proteinových směsí před LC-MS/MS

Ing. Martina Grochalová, Ph.D.

Disertační práce

Separation and fractionation of complex protein mixture before LC-MS/MS

Anotace:

Separační metody jsou mocným nástrojem pro analýzu proteomu umožňující redukci složitosti směsi vstupující do hmotnostního spektrometru a takto zvyšují podíl detekovaných komponent ve vzorku, jehož přímou analýzou lze dosáhnout jen částečného pokrytí komponent s nejvyšším zastoupením ve vzorku, a to i přes obrovský rozmach hmotnostní spektrometrie v posledních letech. Tato disertační práce se věnuje problematice separačních metod aplikovaných pro analýzu proteinů na třech konkrétních projektech. První projekt byl zaměřen na charakterizaci změn cytoplasmatického proteomu suspenzních buněk révy vinné (V. vinifera cv. Gamay) indukovaných infekcí kulturou Botrytis cinerea. Cílem druhého projektu byl podrobný popis celkového proteomu piva přímo z kompletní matrice českého ležáku. Řešení vyžadovalo jak optimalizaci postupu přípravy vzorku, tak i využití frakcionace peptidové směsi a umožnilo detekci maximálního množství proteinů v pivu, které bylo doposud publikováno. Třetí projekt je zaměřen na vývoj metody pro maximální pokrytí proteomu a fosfoproteomu buněčné linie HEK293 v rámci studia Wnt signální dráhy. Tato práce zahrnovala výběr a optimalizaci nejvhodnější separační strategie založené na vícerozměrné kapalinové chromatografii.

Abstract:

Separation methods are a powerful tool for proteome analysis reducing the complexity of the mixture entering to mass spectrometer, which increases the ratio of detected components in a sample. It is not possible to reach same coverage of the sample components by direct analysis compared to separation techniques, all of this despite the large progress of the mass spectrometry over the years. This dissertation thesis deals with problems of separation methods applied on protein analysis in three specific projects. The first project is focused on the characterization of changes in the cytoplasmic proteome of V. vinifera cv. Gamay cells induced by Botrytis cinerea infection. The aim of the second project is a detailed description of the whole beer proteome directly from the complete matrix of Czech lager. The solution required the optimization of the sample preparation procedure, the fractionation of the peptide mixture and the detection of the maximum amount of proteins in the beer that has been published. The third project is focused on the development of the method for maximal coverage of proteome and phosphoproteom of the HEK293 cell line in the Wnt signaling pathway. This work involved the selection and optimization of the most appropriate separation strategy based on multidimensional liquid chromatography.

Klíčová slova

separation, liquid chromatography, multidimensional chromatography, complex protein mixtures, fractionations, RP-RP, LC-MS/MS, separace, kapalinová chromatografie, vícerozměrná chromatografie, komplexní směsi proteinů, frakcionace

Jazyk práce: čeština

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 16. 11. 2017

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 4. 12. 2017
• Vedoucí: doc. RNDr. Zbyněk Zdráhal, Dr.
• Oponent: prof. Ing. Lenka Hernychová, Ph.D., prof. RNDr. Karel Lemr, Ph.D.

Masarykova univerzita

Přírodovědecká fakulta

Doktorský studijní program / obor:
Biochemie (čtyřleté) / Genomika a proteomika