Jaderné a cytoplasmatické aspekty radiosensitizačního účinku kovových nanočástic

Bc. Ema Huščavová

Master's thesis

Nuclear and cytoplasmic aspects of the radiosensitizing effect of metal nanoparticles

Abstract:

Dříve se předpokládalo, že kovové nanočástice (z materiálů s vysokým protonovým číslem) zesilují účinek ionizujícího záření, jelikož po ozáření emitují sekundární elektrony a vedou k produkci reaktivních forem kyslíku (ROS), které mohou poškozovat DNA v buněčném jádře. Nedávno však byla prokázána přítomnost nanočástic výhradně v cytoplazmě, což vede k otázkám, zda je radiosensitizační efekt způsoben primárně poškozením DNA v jádře, nebo zda k radiosenzitizaci nanočásticemi přispívají, případně i dominantně, cytoplazmatické efekty. Jedním z možných cílů jsou lysozomy, důležité organely zapojené do mnoha signálních drah, včetně těch zahrnutých v indukci buněčné smrti. Tato diplomová práce zkoumá účinky zlatých nanočástic (velikosti Au-10: 5 ± 0.2 nm a Au-c: 0.8 ± 0.2 nm) na buňky neozářené nebo ozářené γ zářením. Zaměřuje se na efekty nanočástic v cytoplazmě, a jejich účinky na buňku jako celek, přičemž výsledky porovnává s účinky na jádro. Pomocí klonogenního testu byl pro oba typy studovaných nanočástic v koncentraci 20 μg/ml prokázán radiosensitizační účinek na buňky SkBr3 (adenokarcinom prsu) při expozici buněk různým dávkám γ záření. Mikroskopickou metodou kvantitativního fázového zobrazování byly za účelem sledování vnitrobuněčné distribuce a dynamiky internalizace nanočástic buňkami vizualizovány shluky nanočástic uvnitř živých buněk SkBr3 a NHDF (normální lidské dermální fibroblasty). Sledování po dobu 17 hodin prokázalo heterogenní přítomnost studovaných typů nanočástic pravděpodobně v buněčné cytoplazmě, a podpořilo tak hypotézu o možných cytoplazmatických mechanismech radiosensitizace (nádorových) buněk pomocí kovových nanočástic. Měření pomocí průtokové cytometrie prokázala různé efekty Au-10 a Au-c na distribuci buněk SkBr3 v rámci buněčného cyklu. Zatímco nanočástice Au-10 vykazovaly (i v neozářených buňkách) trend zvyšování proporce buněk ve fázi G2, nanočástice Au-c měly opačnou tendenci (posun směrem k fázi G1). V případě Au-10 lze proto předpokládat, vzhledem k vyšší radiosensitivitě buněk G2 oproti buňkám G1, že vyvolané změny buněčného cyklu mohou přispívat k radiosensitizaci. Odlišný účinek Au-c na buněčný cyklus však naznačuje přítomnost dalších mechanismů (nebo i jejich kombinací), které mohou být závislé na vlastnostech nanočástic. Následně bylo s využitím imunofluorescenčních technik studováno potenciální lysozomální poškození vznikající v důsledku lokálně zvýšené produkce ROS nebo emise elektronů v okolí (ozářených) nanočástic, nicméně permeabilizace lysozomálních membrán nebyla na detekční úrovni použité metody prokázána. Naše další výsledky z průtokové cytometrie naznačují vliv zlatých nanočástic na indukci ROS (konkrétně superoxidu), přičemž časová kinetika produkce pravděpodobně závisí na typu nanočástic. Dohromady výsledky prokázaly radiosensitizační efekt použitých zlatých nanočástic na nádorové buňky SkBr3 v kombinaci s terapeuticky používaným γ zářením. Zároveň naznačují, že mechanismus radiosensitizace zahrnuje cytoplazmatické účinky nanočástic, které se však mohou lišit v závislosti od typu nanočástic.

Abstract:

Metal nanoparticles (composed of high-Z materials) have been suggested to enhance the effects of ionizing radiation, as they emit secondary electrons and produce reactive oxygen species (ROS), which can cause DNA damage in the cell nucleus. However, recent findings have shown the presence of nanoparticles exclusively in the cytoplasm, which leads to questions such as, whether radiosensitization happens mainly through damage of nuclear DNA or whether cytoplasmatic effects also contribute, even dominantly, to the radiosensitizing effect of nanoparticles. Lysosomes are one of the possible targets, as they are important organelles involved in many signaling pathways, including those involved in cell death induction. This diploma thesis studies the effects of gold nanoparticles (Au-10: 5 ± 0.2 nm and Au-c: 0.8 ± 0.2 nm) on cells not irradiated or irradiated with γ-rays. It focuses on the effects of nanoparticles in the cytoplasm and their effects on the cell as a whole and compares them with effects on the nucleus. Using the clonogenic assay, a radiosensitizing effect on SkBr3 cells (breast adenocarcinoma) was shown for both types of used nanoparticles at a concentration of 20 μg/ml upon exposure of the cells to different doses of γ radiation. Using quantitative phase imaging, in order to monitor the intracellular distribution and dynamics of nanoparticle internalization by cells, we visualized clustered nanoparticles inside the living SkBr3 and NHDF (Normal Human Dermal Fibroblasts) cells. Observation for 17 h demonstrated the heterogeneous presence of the studied types of nanoparticles probably in the cell cytoplasm, thus supporting the hypothesis of possible cytoplasmatic mechanisms of radiosensitization of (tumor) cells using metal nanoparticles. Flow cytometry measurements showed different effects of Au-10 and Au-c on the cell cycle distribution of SkBr3 cells. While Au-10 showed (even in non-irradiated cells) a trend of increasing proportion of cells in the G2 phase, Au-c had the opposite tendency (a shift towards the G1 phase). Thus in the case of Au-10, it can be assumed, due to the higher radiosensitivity of G2 cells compared to G1 cells, that induced cell cycle changes may contribute to radiosensitization. However, the different effect of Au-c on the cell cycle suggests the presence of other mechanisms (or their combinations) that may depend on the properties of the nanoparticles. Subsequently, potential lysosomal damage resulting from locally increased ROS production or electron emission in the vicinity of (irradiated) nanoparticles was studied using immunofluorescence techniques, however, permeabilization of lysosomal membranes was not observed at the detection level of the used method. Our other flow cytometry results suggest that gold nanoparticles may enhance ROS (particularly superoxide) production, with temporal kinetics depending on the type of nanoparticles. Overall, the results demonstrated the radiosensitizing effect of the used gold nanoparticles on SkBr3 tumor cells in combination with the therapeutically used γ-rays. Also, results suggest that the mechanism of radiosensitization involves cytoplasmatic effects of the nanoparticles, which may differ depending on the type of nanoparticles.

Keywords

zlaté nanočástice, ionizující záření, radiosenzitizace, klonogenní test, zástava buněčného cyklu, ROS, poškození lysozomů, průtoková cytometrie, kvantitativní fázové zobrazování, gold nanoparticles, ionizing radiation, radiosensitization, clonogenic assay, cell cycle arrest, lysosomal damage, flow cytometry, quantitative phase imaging

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 4. 1. 2023

Thesis defence

• Date of defence: 30. 1. 2023
• Supervisor: doc. RNDr. Martin Falk, Ph.D.
• Reader: Ing. Marie Davídková, CSc.

Masaryk University

Faculty of Science

Master programme / field:
Physics / Biophysics