Komplexy proteinů a nukleových kyselin zajišťující stabilitu genomu

Mgr. Ivona Nečasová, Ph.D.

Doctoral thesis

Nucleoprotein complexes safeguarding genome stability

Abstract:

Nestabilita genomu může být zapříčiněna mnoha faktory, mezi něž patří i nefunkční telomery. Telomery jsou nukleoproteinové komplexy, které se nachází na koncích lineárních chromozomů, aby je chránily před rozpoznáním opravnými mechanizmy DNA jako dvouřetězcové zlomy. Proteiny asociované s konci chromozomů chrání chromozomovou DNA u většiny eukaryot. Tyto proteiny tvoří u savců komplex shelterin, který se podílí na sbalení koncové telomerové DNA do smyček, čímž ovlivňuje přístup regulačních faktorů na DNA. Shelterin dále reguluje přístup telomerázy, ribonukleoproteinového enzymu, který přidává telomerovou DNA ke koncům chromozomů, aby zajistila kompletní replikaci genomu. Protein TRF2 (Telomeric repeat binding factor 2), který se váže sekvenčně specificky k telomerové DNA má centrální úlohu při navázání shelterinu ke koncům chromozomů. TRF2 se dále podílí na tvorbě telomerových smyček a zprostředkovává ochranu telomer. N-koncová bazická doména proteinu TRF2 chrání telomerovou D-smyčku (displacement loop) před štěpením endonukleázami. TRF2 vytváří multifunkční komplex s Rap1 (Repressor activator protein 1), který v nepřítomnosti heterodimeru Ku70/Ku80 potlačuje nežádoucí homologií řízenou opravu telomer. Komplex TRF2-Rap1 tedy představuje důležitou část shelterinu. S cílem odhalit mechanizmus, jakým telomerové proteiny přispívají k ochraně konců chromozomů jsme testovali roli TRF2 i Rap1 v rozvinutí D-smyčky. Abychom porozuměli tomu, jak bazická doména proteinu TRF2 ovlivňuje jeho vazbu k DNA a zpracování D-smyčky, analyzovali jsme DNA vazbu plnodélkového TRF2 a TRF2 bez bazické domény. Kvantifikovali jsme, jak bazická doména přispívá k interakcím TRF2 s DNA a jak Rap1 ovlivňuje DNA-vazebné vlastnosti TRF2. Naše výsledky ukazují, že zatímco bazická doména TRF2 stabilizuje D-smyčku a tím redukuje její rozvinutí, vytvoření komplexu TRF2-Rap1 rozvinutí DNA podpořilo. Dále jsme pozorovali, že v přítomnosti Rap1 je celková vazebná afinita TRF2 k DNA duplexu redukována. Nicméně, selektivita TRF2 k telomerové DNA a jeho lokalizace na jedno-/dvouřetězcových DNA spojeních je zvýšena. Vyřešili jsme také strukturní obálkový model bazické domény vázané k DNA, který odhalil, že zatímco je bazická doména flexibilní v roztoku, při vazbě k DNA se stává rigidní. Nakonec jsme navrhli mechanizmus, jak TRF2 stabilizuje D-smyčky prostřednictvím bazické domény a jak Rap1 tuto stabilizaci oslabuje. Získané poznatky přispívají k objasnění interakcí proteinů asociovaných s telomerami, které jsou nezbytné pro regulaci délky telomer, a tím k udržení stability celého genomu. Tato práce dále shrnuje i další projekty, v jejichž rámci jsem kvantitativně popsala interakce kvasinkových proteinů a předpokládaného rostlinného proteinu s telomerovou DNA.

Abstract:

Genome instability may result from wide varieties of factors, including dysfunctional telomeres. Telomeres are nucleoprotein complexes that form caps at the very ends of linear chromosomes to protect them against recognition as DNA-double-strand breaks by DNA repair machinery. Proteins associated with chromosome ends shelter chromosomal DNA in most eukaryotes. In mammals, the telomere-associated proteins form a complex called shelterin, which folds telomeric DNA termini into loops and thus regulates access of DNA processing factors. Additionally, shelterin regulates telomerase recruitment, a ribonucleoprotein enzyme that adds telomeric DNA to chromosomal ends to ensure complete genome replication. A sequence specific telomere binding protein, TRF2 (Telomeric repeat binding factor 2) plays a central role in recruiting shelterin to chromosomal ends. Moreover, TRF2 participates in telomeric loops formation and mediates telomere protection. The N-terminal basic domain of TRF2 protects the telomeric D-loop (displacement loop) from cleavage by endonucleases. TRF2 forms a multifunctional complex with Rap1 (Repressor activator protein 1) that suppresses unwanted homology-directed repair at telomeres in the absence of the Ku70/Ku80 heterodimer. Thus, the TRF2-Rap1 complex represents an important part of shelterin. To reveal the mechanisms of how telomeric proteins contribute to protection of chromosomes ends, we tested the role of both TRF2 and Rap1 in D-loop unwinding. To understand how the basic domain of TRF2 affects DNA binding and D-loop processing, we analyzed DNA binding of full-length TRF2 and TRF2 lacking the basic domain. We quantified how the basic domain contributes to TRF2’s interaction with DNA and how Rap1 affects DNA binding properties of TRF2. Our results show that whereas the basic domain of TRF2 stabilized the D-loop and thus reduced its unwinding, the TRF2-Rap1 complexation restored DNA unwinding. Additionally, we observed that in the presence of Rap1, the overall binding affinity of TRF2 to DNA duplex is reduced. However, the selectivity of TRF2 for telomeric DNA and its localization on single-/double-stranded DNA junctions is increased. We developed a structural envelope model of the basic domain of TRF2 bound on DNA revealing that whereas the basic domain is flexible in solution, upon binding to DNA becomes rigid. Finally, we proposed a mechanism for how TRF2 stabilizes D-loops via the basic domain and how Rap1 impairs it. The obtained findings contribute to address interactions of telomere-associated proteins that are essential for the regulation of telomere length and thus maintenance of whole genome stability. In addition, the thesis also summarizes other projects within which I quantitatively described interactions of yeast telomeric proteins and a plant putative telomeric protein with telomeric DNA.

Keywords

telomery, DNA, protein, izotermální titrační kalorimetrie, fluorescenční spektroskopie, interakce protein-DNA, telomeres, isothermal titration calorimetry, fluorescence spectroscopy, protein-DNA interaction

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 18. 4. 2019

Thesis defence

• Date of defence: 30. 5. 2019
• Supervisor: doc. Mgr. Ctirad Hofr, Ph.D.
• Reader: Mgr. Veronika Altmannová, Ph.D., doc. RNDr. Petr Pečinka, CSc.

Masaryk University

Faculty of Science

Doctoral programme / field:
Biochemistry (4-years) / Genomics and Proteomics