The Carpet of the Sun - On the Quantification of Algal Biomass

Cornelia Johanna Carpentier, Ph.D.

Doctoral thesis

Abstract:

Je známo mnoho různých způsobů jak stanovit množství řas, či jejich biomasu. Není však jedna nejlepší metoda použitelná pro analýzu biomasy řas. Rozhodnutí o tom, která metoda je nejvhodnější závisí především na účelu, pro který metodu vybíráme. Cíle této práce se vztahují k různým metodám a způsobům stanovení biomasy řas, jako například objemové biomase v kombinaci s počty buněk, měření absorpce in vivo nebo in vivo fluorescence. Počty buněk a objemová biomasa Poloautomatická metoda pro stanovení objemové biomasy řas za současného počítání buněk pod mikroskopem byla vyvinuta za pomocí digitální analýzy obrazu. Nejdříve jsou vyhodnoceny geometrické parametry, které jsou přiřazovány k jednotlivým taxonům fytoplanktonu. Celkové obrysy jsou převedeny na geometrické tvary a měřitelné dimenze jsou definovány jako například Staurastrum a Ceratium. Zaprvé bylo nutné harmonizovat strategii počítání s měřením objemové biomasy pro vláknité a cenobiální řasy zavedením “počítací jednotky”. Zadruhé, statistická vyhodnocovací metoda byla vyvinuta tak, aby bylo možno použít databázi pro měření a analýzy (aplikace BACCHUS). Statistická analýza byla použita pro dva účely: 1. Definovat požadovanou přesnost objemové biomasy ve smyslu definovat minimální počty měření které musí být realizovány a tím minimalizovat nutné úsilí. 2. Umožnit statistické vyhodnocení objemové biomasy a měření jednotlivých buněk s cílem redukovat počty taxonů a jejich rozměrů, které musí být měřeny. Díky statistickému vyhodnocení se stala tato aplikace velmi silným nástrojem, který minimalizuje čas a úsilí nutný k získání dostatečně precizních dat o objemové biomase. Praktické odzkoušení v laboratory s několika techniky ukázalo, že počty buněk mohou být kombinovány s objemovou biomasou snadno a komfortně. Je dobré zmínit, že při rutinním zpracování vzorků není přítomno dostatek jedinců pro získání dostatečné přesnosti. Ikdyž není využita analýza obrazu pro stanovení objemové biomasy, statistická analýza šetří čas nutný pro zpracování vzorku. In vivo absorpce Nově vytvořená evropská směrnice European Guidance Standard EN 16161 (2012) pro detekci koncentrace chlorofylu-a in vivo absorpční metodou byla porovnána s dalšími běžně používanými metodami pro detekci chlorofylu-a, jako je ISO 10260 (1992). Rozložení absorpčního spektra pomocí Gausovy křivky, jak již dříve prokázaly výsledky řady vědců, dává dobrou shodu pro parametry křivky, i když volně modifikované 3 (pro chlorofyl– a absorbce okolo 675 nm), dává lepší výsledky než fixní vlnová délka 675nm. Srovnávat výsledky dle metody EN 16161 s ISO 10260 se zdá nemožné a proto použitelnost EN 16161 Guidance Standard zůstává problematická, dokud tento problém nebude vyřešen. Metoda stanovení biomasy fytoplanktonu pomocí in vivo fluorescence Mikroskopická metoda stanovení počtu buněk toxických sinic, na které je v legislativě založena Signální koncentrace představuje časově velmi náročnou metodu, kdy je prodleva ve získání výsledků, zatímco pro veřejné zdraví je vyžadována rychlá aktivita. Online a in-situ fluorescenční techniky mají výhodu vysoké frekvence a rychlosti pořízení dat. Tyto možnosti jsou důležité speciálně pro monitoring pitných vod, především v povrchových zdrojích, kde se toxické sinice mohou vyskytovat. Předložená studie přináší konverzní parametry převodu počtu buněk sinic používaných v signálních úrovních platné legislativy na koncentrace chlorofylu-a. Dizertační práce ukazuje realizaci převodu počtu buněk na in vivo fluorescenci kvantifikovanou jako chlorofyl-a, včetně příkladu aplikace těchto signálních hladin v nádrži v Polsku poblíž Varšav

Abstract:

y. Stanovení biomasy fytobentosu pomocí in vivo fluorescence Primární produkce fytobentosu je především v případě řek považována za přijatelný indicator kvality vody, protože mikroorganismy s krátkým životním cyklem přijímají živiny a rychle reagují na měnící se podmínky. Navíc společenstva fytobentosu jsou důležitým ekologickým parametrem podporovaným vodními proudy a závisející na predaci zoobentosem, čímž významně modifikují vodní prostředí. Empirické modely spojené s biomasou řas a živinami ve vodném sloupci byly široce využívány pro management trofie jezer a přehrad. Stanovení podobných vztahů řas a živin pro toky se jeví mnohem složitější a proto méně pokročilé, protože tyto vztahy jsou mnohem slabší než v jezerech. Problémy vzniklé obohacením vody živinami – estetické, ztráta zoobentosu citlivého na znečištění, přerůstání substrátů fytobentosem a degradace kvality vody (například fluktuace rozpuštěného kyslíku, či zvýšené pH) máji za následek například úhyny ryb a proto jsou tématem pro management kvality vody toků. Navíc - modely pro hodnocení eutrofizace toků by měly být rozšířeny o parametry, které jsou schopny hodnotit parametry důležité pro potravní sítě lotických ekosystémů. Tato práce vykonala první krok pro vývoj vhodné terénní metody kvantifikace celkové biomasy a skupin řas fytobentosu, která není omezena problémem spojeným s kvantitativním vzorkováním. Do hodnocení řeky Dunaje byly využity data kvantifikace fytobentosu jako parametru kvality vody. Tato data budou dále využita ke srovnání a korelacím s dalšími parametry kvality vody. Reálná data z terénu mohou být použita k nastavení modelu trofie toků pomocí vztahu živinyfytobentos. Další výzkum může navázat na stanovení skupin fytobentosu a jejich vztahy v různém trofickém prostředí. Takto vyvinutý systém může být použit pro hodnocení trofie toků jako část hodnocení ekologického stavu v souladu s Rámcovou směrnicí

Abstract:

There are many different ways to determine algal densities or biomass. There is no such thing as the best method to analyse algal biomass. The decision on what method to use largely depends on the purpose of the study performed. The objectives of this study were related to various different ways of determining algal biomass, such as by algal biovolume combined with cell counts, measuring in vivo absorption or in vivo fluorescence. Algal cell counts and biovolume A semi-automated method to determine algal biovolume while performing microscopic cell counts was developed with the help of digital image processing technology. Firstly, geometric shapes were defined and assigned to phytoplankton taxa. Complex shapes were converted to combinations of geometrical shapes and measurable dimensions were defined, such as for Staurastrum and Ceratium. Additionally, it was necessary to harmonise the counting strategy with the biovolume measurements for filamentous and coenobium-forming algae, thereby introducing the “counting-unit”. Secondly, the database and measurement routine of the BACCHUS application were developed, including a statistical evaluation method. The statistical analysis was used for two purposes: 1. to define the required precision of the biovolume results in order to define a maximum number of measurements to be performed, thus minimising the effort involved; 2. to enable a statistical evaluation of both biovolume results and individual dimensions, in order to reduce the number of taxa or dimensions to be measured. The statistical analysis made this application a very powerful tool, since it helped to minimise the amount of time and effort needed to perform a suitably precise biovolume analysis. Practice in the laboratory with several technicians showed that plankton counts can be combined with biovolume measurements very easily and comfortably. It has to be noted that in routine samples not enough individuals of a taxon may be present in the sample to achieve the desired precision. However, even if no image analysis system is used to measure biovolumes, the statistical analysis can be used to reduce the time needed for analysis. In vivo absorption The newly developed European Guidance Standard EN 16161 (2012) on in vivo absorption methods to determine chlorophyll-a concentrations was compared to other commonly used methods for the determination of chlorophyll-a, such as ISO 10260 (1992). The decomposition of absorption spectra by means of Gauss curves as previously shown by numerous other researchers results in adequate fit curves, although a freely modifiable 3 (for chlorophyll-a absorption around 675 nm) yields better results than a fixed value at 675 nm. It appeared to be impossible to correlate the EN 16161 results to chlorophyll-a concentrations as determined with the ISO 10260 method. Thus, the applicability of the EN 16161 Guidance Standard remains questionable until this issue has been resolved. In vivo fluorescence methods to determine phytoplankton biomass An Alert Level Framework for harmful cyanobacteria based on microscopic cell counts has a major disadvantage: microscopic cell counts are generally time-consuming, and as such valuable time can be lost waiting for the results, whereas adequate and timely actions are required to ensure public safety. Online and on-site fluorescence techniques have the advantage of being able to analyse samples at a higher frequency and produce results faster. These features are especially important in the monitoring of drinking water intake points where toxic algae blooms may appear suddenly, requiring immediate action. In the study, however, this required a conversion of the Alert Levels units from cell densities to cyanobacterial chlorophyll-a levels. This thesis shows how the conversion from cell counts to in vivo fluorescence measurements of chlorophyll-a was accomplished, including an example of the application of this Alert Level Framework in a lake near Warsaw, Po

Abstract:

land. In vivo fluorescence methods to determine phytobenthos biomass Especially in rivers, phytobenthic primary productivity is considered to be a suitable indicator of stream water quality, since the short-lived organisms are generally sessile, take up nutrients from the water phase and respond rapidly to a changing environment. Moreover, benthic algal communities are important parameters in ecological investigations since they support lotic food webs as a food source for grazers and they can attenuate currents and stabilise sediments, thereby modifying the aquatic habitat. Empirical regression models which link algal biomass and water column nutrients have been widely used in the eutrophication management of freshwater lakes and reservoirs. Establishing similar relationships for nutrients and phytobenthos biomass in streams has appeared more difficult and is thus less advanced, since these links are generally weaker in streams than in lakes. Problems caused by enrichment – such as aesthetic degradation, loss of pollution-sensitive invertebrate taxa through smothering of substrata by algae, clogging of water intake structures and degradation of water quality (particularly dissolved oxygen and pH) resulting in fish kills – may be addressed by such relationships, thus providing an objective framework for stream water quality management. Additionally, eutrophication models for streams can be extended to predict ecosystem properties important to lotic food web structures. This study has taken the first step in this direction by developing a suitable field method to measure phytobenthos biomass per algal group, without the problems related to quantitative sampling. Some assessment results of the first elaborate dataset for the Danube River are shown, including phytobenthos biomass as a parameter. However, further datasets of different types of streams and rivers now need to be collected and evaluated. The field data thus collected can serve as reliable input for the establishment of a model for the nutrient-phytobenthos biomass relationship, in order to assess the trophic state of rivers and streams. Further research is then necessary to actually develop such a model and identify class boundaries for phytobenthos biomass. Once developed, it may provide a practical routine method to assess the trophic state of rivers and streams as part of their ecological status in accordance with the Water Framework Directive.

Keywords

phytobenthos, phytoplankton, cyanobacteria, fluorescence, biomass, biovolume fytobentos, fytoplankton, sinice, biomasa, biovolume

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 24. 6. 2014

Thesis defence

• Date of defence: 26. 6. 2014
• Supervisor: prof. Ing. Blahoslav Maršálek, CSc.
• Reader: prof. RNDr. Luděk Bláha, Ph.D., RNDr. Štěpán Zezulka, Ph.D., Mgr. Markéta Fránková, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Science

Doctoral programme / field:
Biology (4-years) / Ekotoxicology