Studium funkčních vlastností kryokonzervovaných prasečích spermií ve vztahu k fertilizaci in vitro

Mgr. Soňa Kloudová, Ph.D.

Doctoral thesis

The study of Functional Status of Cryopreserved Porcine Spermatozoa in Relation to Fertilization in vitro

Abstract:

V posledních letech byl zaznamenán velký pokrok v účinnosti biotechnologií používaných v oblasti reprodukce prasat. Ačkoliv bylo dosaženo výrazného zlepšení ve zrání prasečích oocytů in vitro, metody produkce prasečích embryí v laboratoři stále nejsou dostatečně efektivní. Jedním ze zásadních problémů je vysoká variabilita účinnosti fertilizace prasečích oocytů při použití čerstvého spermatu. Jednou z možností, jak lze tuto skutečnost eliminovat je použití kryokonzervovaných spermií připravených ve vysokém počtu inseminačních dávek se standardní fertilizační schopností. Kančí spermie jsou však velmi náchylné k negativním účinkům zmrazování a rozmrazování, a proto je obtížné dosáhnout odpovídající funkční stav kryokonzervovaných a kapacitovaných spermií nezbytný pro efektivní fertilizaci oocytů. S cílem zajistit dostatečný počet inseminačních dávek standardní kvality vhodných pro fertilizaci in vitro byla na základě modifikace média pro chlazení spermií pomocí trehalózy optimalizována metoda kryokonzervace kančího spermatu a testováno roční období, ve kterém je kryokonzervace nejefektivnější. Bylo ověřeno, zda je možné prognozovat kryotoleranci u kanců pomocí hodnocení funkčních vlastností jejich spermií před kryokonzervací. Byly charakterizovány změny funkčních vlastností probíhající u kryokonzervovaných, separovaných a kapacitovaných spermií s cílem definovat vztah mezi charakterem těchto změn a fertilizační schopností spermií in vitro. Pro hodnocení funkčního stavu kryokonzervovaných spermií byly zvoleny následující parametry - motilita, viabilita a integrita akrozomu, v závěrném experimentu také integrita DNA a plazmatických membrán spermií. Bylo prokázáno, že modifikace standardního média pro chlazení spermií před kryokonzervací pomocí trehalózy signifikantně zvýšila motilitu, viabilitu a integritu akrozomu spermií nezávisle na stupni kryotolerance dárců spermií. Bylo potvrzeno že kryokonzervace spermatu kanců je efektivnější v chladnějším ročním období. Bylo zjistěno, že na základě námi zvolených parametrů nelze predikovat toleranci kanců ke kryokonzervaci jejich spermií. Bylo potvrzeno, že separace na gradientu Percollu neovlivňuje negativně spermie, účinnost separace byla vyšší u kanců s nižší kryotolerancí. Také ošetření kofeinem nemělo negativní účinek na funkční stav spermií. Bylo zjištěno, že DNA byla vysoce stabilní v průběhu kryokonzervace, separace i kapacitace spermií. Byl nalezen potencionální vztah, mezi průběhem akrozomální reakce u kryokonzervovaných kančích spermií a efektivitou fertilizace zralých oocytů in vitro. Průběh akrozomální reakce byl specifický pro spermie každého individuálního kance a bylo možné jej modifikovat kofeinem. Proto je důležité, testovat odezvu spermií kanců na kofein a rozvoj akrozomální reakce před jejich použitím pro fertilizaci in vitro a produkci prasečích embryí.

Abstract:

In recent years a great effort has been made to improve the efficiency of porcine reproduction biotechnology. Although many improvements have been achieved in in vitro maturation (IVM) and fertilization (IVF) of oocytes, today’s methods for porcine embryo production are still not efficient enough. The results of in vitro fertilization of pig oocytes using fresh semen greatly vary in the same boar. To eliminate this problem, cryopreserved semen from boars with proved in vitro fertility should be used and high number of insemination doses with a standard fertilizing ability of spermatozoa should be obtained from their ejaculates. Unfortunately the boar spermatozoa are extremely susceptible to the freezing-thawing process and a good functional status of frozen-thawed boar spermatozoa is a prerequisite for successful in vitro fertilization. With the aim to ensure a sufficient count of insemination dows of standard quality, which are suitable for oocyte in vitro fertilization, the method for cryopreservation of fertile boar semen was optimized. The effect of the modification of the cooling medium by trehalose was studied. Simultaneously was tested in which season of the year the sperm cryopreservation is most effective. The changes in functional parameters of cryopreserved spermatozoa after cryopreservation, separation and capacitation were studied. A question that was looked at within the frame of this experiment was, if it is possible to predict the sperm cryotolerance of individual boars before freezing. In the last part of the study the changes in sperm functional status in individual boars during the capacitation were assessed. The focus was on finding a potential relationship between these changes and efectivity of porcine oocyte in vitro fertilization. Sperm motility, viability, acrosome integrity, membrane integrity and DNA integrity were evaluated in this study. It was documented, that a modification of standard cooling extender improved significantly the motility, viability and acrosome integrity regardless of the spermatozoa cryotolerance. The cryoconservation was more effective in the colder season of the year. Cryotolerance of spermatozoa of individual boars could not be predicted before cryopreservation. The separation of motile spermatozoa on Percoll-gradient did not negatively influence the frozen-thawed spermatozoa and was more effective for the low cryotolerant- compared with the high cryotolerant- boars. The caffeine treatment did not negatively influence the spermatozoa functional status. The DNA integrity of spermatozoa was highly stable during the cryopreservation, separation and capacitation. It can be concluded that there is a potential relationship between the acrosome reaction progress in frozen-thawed boar spermatozoa and the efficiency of in vitro fertilization. The modulation of acrosome reaction progress by a suitable level of caffeine can improve fertilization in terms of monospermy. Since the ability of spermatozoa to undergo the acrosome reaction was specific for each boar, it is important to test boars before their use for embryo production.

Keywords

prasečí spermie, kryokonzervace, trehalóza, funkční vlastnosti spermií, kofein, průběh akrozomální reakce, fertilizace in vitro boar spermatozoa, cryopreservation, trehalose, sperm functional status, caffeine, acrosome reaction progress, in vitro fertilization

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 16. 2. 2011

Thesis defence

• Date of defence: 15. 3. 2011
• Supervisor: Ing. Marie Machatková, CSc.
• Reader: prof. Ing. Ladislav Máchal, DrSc., prof. Ing. Jiří Rozinek, CSc.

Masaryk University

Faculty of Science

Doctoral programme / field:
Biology (4-years) / Animal Physiology