Spektrofotometrické a potenciometrické stanovení disociačních konstant cytostatika bosutinibu regresní analýzou

Bc. Veronika Nečasová

Master's thesis

Spectrophotometric and potentiometric determination of dissociation constant of anti-tumor drug bosutinib using regression analysis

Abstract:

Kombinací potenciometrické a spektrofotometrické indikace při pH-titraci multiprotického cytostatika bosutinibu u stanovení protonačních konstant byly porovnány výsledky dvou instrumentálních metod. Cytostatikum bosutinib slouží k léčbě pacientů trpících pozitivní chronickou myeloidní leukémií. Léčivo vykazuje čtyři protonovatelná místa v rozmezí pH 2-11, kde dvě z nich jsou dobře oddělené, čili vykazují log K > 3, zatímco další dvě jsou blízké disociační konstanty. V neutrálním prostředí pH 7 se vyskytuje bosutinib ve vodě v obtížně rozpustné formě LH, která se protonací převede až do rozpustného kationtu LH43+ a LH může disociovat na obtížně rozpustný anion L-. Protonace molekuly přináší dostatečnou změnu v UV spektru při nízké koncentrací 10-5 mol/l. Vějíř naměřeného spektra bosutinibu v závislosti na pH od 2 do 11 v oblasti 239.3 375.0 nm byl rozdělen na dva absorpční pásy, první v oblasti 239.3 - 290.5 nm a druhý 312.3 - 375.0 nm, které se liší citlivostí chromoforů na změnu pH. Odhady disociačních konstant z celého vějíře spektra byly porovnány s odhady z obou absorpčních pásů. Počet světlo-absorbujících částic protonačních rovnovah byl určen z hodnosti druhého momentu absorbanční matice za porovnání Kankareho-Wermontovy metody s 11 dalšími v programu INDICES. Pro omezenou rozpustnost byla protonace bosutinibu sledována ve vodně-metanolickém prostředí. I když Box et al tvrdí, že v kyselé oblasti pH 2 až 7 změna pH neovlivňuje dostatečně chromofory bosutinibu a chromofor není schopen rozlišit disociaci do dvou stupňů, ukázali jsme, že při nízkém obsahu metanolu od 3 do 6% lze spolehlivě stanovit tři disociační konstanty o odhadech pKa1 = 3,41, pKa2 = 4,69 a také pKa3 = 6,4. Byly vyčísleny koncentrační disociační konstanty nelineární regresí absorbanční matice programy SPECFIT/32 a SQUAD(84), které po extrapolaci na nulový obsah metanolu vedly k těmto hodnotám pro 25°C pKc1= 11,04(05), pKc2= 7,56(07), pKc3= 4,54(10) a pKc4= 3,43(12) a při 37°C pKc1= 10,92(06), pKc2= 7,33(05), pKc3= 5,03(08) a pKc4= 3,44(06). Distribuční diagram relativního zastoupení rozličně protonovaných částic bosutinibu v závislosti na pH titrace ukazuje, že se zvyšujícím se obsahem metanolu v rozpouštědle se potlačuje disociace a klesá procento zastoupení částice LH32+ a v roztoku převažuje částice LH. Z naměřených dat potenciometrickou pH-titrací při 25°C byly pomocí programů ESAB a HYPERQAD vyčísleny čtyři koncentrační disociační konstanty, které po extrapolaci na nulový obsah metanolu vedly k těmto hodnotám: pro ESAB pKc1= 11,05(03), pKc2= 7,97(02), pKc3= 4,37(02) a pKc4= 3,51(02), pro HYPERQUAD pKc1= 11,29(05), pKc2= 7,95(07), pKc3= 4,24(10) a pKc4= 3,29(12). Vedle odhadu disociační konstanty byly zjemňovány i specifické parametry, celková analytická koncentrace léčiva L0 a analytická koncentrace titrantu HT.

Abstract:

A combination of potentiometric and spectrophotometric indication at pH-titration multiprotic cytostatics Bosutinib for determining protonation constants were compared to the results of two instrumental methods. Cytostatic Bosutinib treats patients with positive chronic myeloid leukemia. The medicament exhibits four protonatable sites in the pH range 2 to 11, where two of them are well separated, as they exhibit log K> 3, while the other two are near dissociation constants. In the neutral medium of pH 7 Bosutinib occurs in water sparingly soluble form LH that can be protonation converted to the soluble cation LH43+ while LH can be dissociated into still difficultly soluble anion L-. Protonation of molecules provides sufficient change in the UV spectrum at a low concentration of 10-5 mol/l. The set of Bosutinib measured spectra depending upon pH from 2 to 11 in the 239.3 to 375.0 nm was divided into two absorption bands, first one of 239.3 to 290.5 nm, while the second from 312.3 to 375.0 nm, which chromophores differ in sensitivity to a change in pH. Estimates of the dissociation constants of the entire set of spectra were compared with the estimates of the two absorption bands. The number of light-absorbing species of all protonation equilibria were determined from the rank of the second moment of absorbance matrix for a comparison of the Kankare-Wermont method with 11 others in the program INDICES. Due to limited solubility of Bosutinib the protonation in the mixed aqueous-methanolic medium was studied. Although Box et al argues that the pH change does not affect enough chromophores of Bosutinib and therefore it is not possible to distinguish dissociation into two stages, we have proven that in low methanol content of 3 to 6% three dissociation constants can be reliably determined with the estimates pKa1 = 3.41, pKa2 = 4.69 and pKa3 = 6.4. Dissociation constants by nonlinear regression programs SPECFIT/32 and SQUAD(84) were estimated, which after extrapolation to zero content of methanol led to following values for 25°C pKc1 = 11.04(05), pKc2 = 7.56(07 ), pKc3 = 4.54(10) and pKc4 = 3.43(12), and at 37°C pKc1 = 10.92(06), pKc2 = 7.33(05), pKc3 = 5.03(08) and pKc4 = 3.44(06). The distribution diagram of relative concentration of variously protonated species of Bosutinib depending upon the pH within a titration shows that with an increasing content of methanol in the solvent the dissociation is suppressed and the percentage representation of the LH32+ particle decreases and in solution LH prevails. From the data of the potentiometric pH-titration at 25°C using the programs and ESAB and HYPERQUAD four concentration dissociation constants were calculated and after extrapolation to zero content of methanol they lead to the following values with ESAB pKc1 = 11.05(03), pKc2 = 7,97(02), pKc3 = 4.37(02) and pKc4 = 3.51(02) and with HYPERQUAD: pKc1 = 11.29(05), pKc2 = 7.95(07), pKc3 = 4.24(10) and pKc4 = 3.29(12). Besides an estimation of dissociation constants the specific parameters are also refined, i.e. the total drug concentration L0 and the analytical titrant concentration HT. The goodness-of-fit test has proven the best titration curve-fitting.

Keywords

Disociační konstanty, bosutinib, spektrofotometrická titrace, potenciometrická titrace, SQUAD(84), SPECFIT/32, ESAB, HYPERQUAD

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 5. 5. 2015

Thesis defence

• Date of defence: 2. 6. 2015
• Supervisor: prof. RNDr. Milan Meloun, DrSc.

University of Pardubice

Faculty of Chemical Technology

Master programme / field:
Chemistry / Analytical Chemistry