Stanovení glutathion-S-transferasy v lyzátech hepatocytů

Mgr. Veronika Mrkvová

Master's thesis

Glutathione-S-transferase assay in hepatocytes lysates

Abstract:

Glutathion-S-transferázy (GSTs) jsou multifunkční enzymy (cytosolické, mitochondriální a mikrosomální), podílející se na metabolismu širokého spektra xenobiotik včetně karcinogenů a endogenních látek. Tyto enzymy katalyzují nukleofilní reakci redukovaného glutathionu s nepolárními sloučeninami, které obsahují elektrofilní uhlík, dusík nebo atom síry. GSTs jsou také zapojeny v biosyntéze leukotrienů, prostaglandinů, testosteronu, progesteronu a v degradaci tyrosinu. GSTs mají také velký význam v antiastmatické a protinádorové terapii, neboť jsou schopny metabolizovat protirakovinná chemoterapeutika, karcinogeny a produkty oxidačního stresu. Naopak snížená hladina GST může vést k tvorbě nejrůznějších nádorů. GST aktivita se nejčastěji stanovuje spektrofotometricky při 340 nm. K tomuto stanovení se používá standardní substrát 1-chloro-2,4-dinitrobenzen, který je vhodný k detekci aktivity u ?, ? i ?-třídy GST isoenzymů a jako kosubstrát se používá glutathion. Tempo růstu absorbance je přímo úměrné GST aktivitě ve vzorku. Cílem této práce bylo testování vlivu různých parametrů metodiky (teplota, pH, doba inkubace, typ pufru) na stanovení aktivity glutathion-S-transferázy v lyzátech potkaních hepatocytů a u purifikované koňské GST a zjištění optimálních parametrů. Byly zjištěny tyto optimální parametry metodiky: draselný fosfátový pufr pH 7,4, T = 21 °C. Byl testován růst signálu v závislosti na koncentraci GSH a CDNB, kdy při koncentraci CDNB vyšší jak 3,6 mmol/l byl pozorován pokles aktivity. GST je stabilní při 4 °C po dobu 24 hodin, ale opakovaným zamražením/rozmražením se aktivita ztrácí. Dále byl sledován inhibiční vliv ethakrynové kyseliny na aktivitu GST. Aktivita ve vzorcích a standardu, vyjádřená v U/mg proteinu, byla porovnána s kontrolní aktivitou a byla vyjádřena jako procento kontrolního signálu. Při použití 50 ?M koncentrace EA činí aktivita GST ve vzorcích i standardu 14 % kontrolního signálu. Výhodou tohoto stanovení je časová nenáročnost a tím i možnost měření velkého množství vzorků během krátké doby. Mikromolární koncentrace ethakrynové kyseliny lze pravděpodobně použít u buněčných kultur nezávisle na jejich druhu k in vitro inhibici GST aktivity.

Abstract:

Glutathione-S-transferases (GST) are multifunctional enzymes (cytosolic, mitochondrial and microsomal) involved in the metabolism of a broad range of xenobiotics including carcinogens and endogenous compounds. These enzymes catalyze the nucleophilic reaction of reduced glutathione with nonpolar compounds that contain electrophilic carbon, nitrogen, or sulphur atom. GSTs are also involved in the biosynthesis of leukotrienes, prostaglandins, testosterone, progesterone, and degradation of tyrosine. GSTs are important in antiasthmatic and antitumor therapy too because these cells are able to metabolize both cancer chemotherapeutic agents, carcinogens and products of oxidative stress. In contrast, decreased levels of GST may lead to the formation of various tumors. GST activity is mostly determined by spectrophotometric method at 340 nm. This setting uses the standard substrate 1-chloro-2,4-dinitrobenzene, which is suitable for ?, ? and ?-class GST isoenzymes, glutathione is used as a co-substrate. The rate of increase of absorbance is directly proportional to GST activity in the sample. The aim of this study was to estimate the influence of various parameters of the method (temperature, pH, incubation time, buffer type) on the activity of glutathione-Stransferase in rat hepatocytes lysates and in purified equine GST. We determined the optimal parameters of the method: potassium phosphate buffer pH 7.4, T = 21 ° C. We also estimated an influence of various concentrations of GSH and CDNB; interestingly, the concentration of CDNB higher than 3.6 mmol/l was observed to decrease the final GST activity. GST is stable at 4 °C for 24 hours, but repeated freeze/thaw cycles caused lost of the activity. Furthermore, the inhibitory influence of ethacrynic acid on GST activity was assessed. The activity in samples and standards, expressed as U/mg protein, was compared with the control activity and expressed as a percentage ratio of the control signal. When using 50 mM EA concentration, GST activity in samples and standards decreased to 14 % of the control signal. The advantage of this assay is time modesty, thus the possibility of measuring large numbers of samples within a short time. Micromolar concentration of ethacrynic acid could be used in cell cultures, despite their type, to inhibition of GST activity in vitro.

Keywords

glutathion, glutathion-S-transferáza, oxidační stres, xenobiotika, CDNB, ethakrynová kyselina, spektrofotometrie

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 4. 5. 2010

Thesis defence

• Date of defence: 2. 6. 2010
• Supervisor: doc. RNDr. Tomáš Roušar, Ph.D.

University of Pardubice

Faculty of Chemical Technology

Master programme / field:
Special Chemical and Biological Programmes / Analysis of Biological Materials