NMR studie paramagneticky a specificky izotopově značeného mikrotubuly vázajicího proteinu 2c

Bc. Alice Laníková

Diplomová práce

NMR study of paramagnetically and specifically isotope labeled Microtubule Associated Protein 2c.

Anotace:

Vnitřně neuspořádané proteiny (intrisically disordered proteins, IDPs) jsou v současnosti považovány za důležitou součást fyziologických procesů v organismech. Jedním z neuspořádaných proteinů je i mikrotubuly vázající protein 2c (MAP2c), který se podílí na regulaci stability a dynamiky mikrotubulů ve vyvíjejících se neuronech. V této práci byla použita NMR spektroskopie pro studium mechanismů interakcí MAP2c s vazebnými partnery a s nimi spojených konformačních změn. Nejprve bylo využito specifického izotopového značení aminokyselin pro přiřazení a další charakterizaci N-terminálního MAP2c v komplexu s dimerizační a dokujicí doménou regulační podjednotky RIIα (RIIDD) cAMP-dependentní proteinkinázy A (PKA). RII vazebné místo samo o sobě vykazuje odlišné dynamické vlastnosti. Analýza získaných chemických posunů ukazuje, že konformace toho místa se po~navázání RIIDD výrazně změní ze dvou α-helikálních úseků s nataženým linkerem mezi nimi na uspořádaný helix. V druhé části tato diplomová práce zkoumá dynamiku volného MAP2c a efekt fosforylace pomocí paramagnetického značení. MAP2c fosforylované extracelulární signálem regulovanou proteinkinázou 2 (ERK2) vykazuje různé změny v kontaktech mezi opakováními vázající mikrotubuly a jinými částmi proteinu oproti nefosforylovanému MAP2c. Analýza paramagnetického zesílení relaxace a interference relaxace poukazuje na existenci kompaktnějších úseků v celé sekvenci MAP2c a popisuje vzájemnou závislost prostorového uspořádání těchto úseků řetězce. Výsledky této práce zdůrazňují strukturní a dynamickou složitost MAP2c, která se odráží v jeho funkcích.

Abstract:

Intrinsically disordered proteins (IDPs) are nowadays recognised as essential components of many physiological processes in organisms. One of the IDPs is the microtubule associated protein 2c (MAP2c) which participates in the regulation of stability and dynamics of the microtubules in developing neurons. Here, we employ NMR to study the dynamic behaviour of MAP2c in order to better understand the mechanisms behind its interactions with binding partners and associated conformational changes. First, specific isotopic labelling of amino acids was used to assign and further characterise the N-terminal MAP2c in complex with the dimerization and docking domain of the regulatory subunit RIIα (RIIDD) of the cAMP-dependent protein kinase A (PKA). The free RII binding region already showed distinct dynamic properties. The analysis of the obtained chemical shifts revealed that the binding site significantly changes its conformation upon binding of the RIIDD from two α-helical motifs bridged by an extended linker to a well-ordered helix. In the second part, the dynamics of free MAP2c and the effect of phosphorylation were explored by paramagnetic labelling. MAP2c phosphorylated by extracellular signal-regulated protein kinase 2 (ERK2) shows various changes in contacts between the microtubule-binding repeats and other parts of MAP2c compared to unphosphorylated MAP2c. The analysis of paramagnetic relaxation enhancement and interference indicates the existence of more compacted segments throughout the sequence of MAP2c and describes the mutual dependence of spatial arrangement of various regions of the protein chain. The results of this thesis highlight the structural and dynamic complexity of MAP2c that is reflected in its functions.

Keywords

mikrotubuly vázající protein 2c, nukleární magnetická resonance, značení proteinů, paramagnetické zesílení relaxace, paramagnetická interference relaxace, cAMP-dependentní proteinkináza A, přirozeně neuspořádané proteiny, mictrotubule associated protein 2c, nuclear magnetic resonance, protein labelling, paramagnetic relaxation enhancement, paramagnetic relaxation interference, cAMP-dependent protein kinase A, intrinsically disordered proteins

Jazyk práce: angličtina

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 19. 5. 2022

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 14. 6. 2022
• Vedoucí: prof. Mgr. Lukáš Žídek, Ph.D.
• Oponent: Mgr. Pavel Srb, Ph.D.

Masarykova univerzita

Přírodovědecká fakulta

Magisterský studijní program / obor:
Biochemie / Biomolekulární chemie