Fragmentace kondenzovaných anthokyaninů

Mgr. Ondřej KURKA

Doctoral thesis

Fragmentation of condensed anthocyanins

Abstract:

Disertační práce se zabývá studiem fragmentačního chování kondenzovaných anthokyaninů v kolizní cele hmotnostního spektrometru. Teoretická část práce je věnována přehledu kondenzovaných anthokyaninových derivátů s detailnější diskusí pyranoanthokyaninů a furanoanthokyaninů, dále možnostem hmotnostní spektrometrie pro studium fragmentačního chování a také výpočetním metodám v chemii a jejich využití v tandemové MS analýze. První část práce je věnována semisyntéze dvou nových izomerních anthokyaninových barviv 5-methylpyranopelargonidinu a 4-methylfuranopelargonidinu reakcí pelargonidinu s acetonem. Byl sledován časový vývoj obou izomerů ve směsi v čase a po dosažení dostatečného výtěžku těchto barviv byla tato ze směsi izolována semipreparativní chromatografickou metodou vyvinutou pro tento účel. Identita izolovaných barviv byla ověřena pomocí NMR. Druhá část práce se zabývá vývojem rychlé chromatografické metody pro separaci obou derivátů a nativního anthokyaninu pelargonidinu. Byla vyvinuta gradientová UHPLC/MS metoda využívající reverzní stacionární fáze a jednoduchých vodně-organických mobilních fází, která dovolovala tyto látky separovat v čase kratším než 1 minuta. Pro použití v uspořádání bez hmotnostního spektrometru byla optimalizována také izokratická UHPLC/PDA metoda. Třetí část práce se věnuje sledování fragmentačního chování izolovaných pelargonidinových derivátů v MS/MS a porovnání jejich fragmentačních spekter. Obě látky poskytují shodné fragmenty, liší se ale v jejich relativních intenzitách a na základě pozorovaných rozdílů je možné obě látky odlišit. Významnými sledovanými fragmentačními procesy jsou ztráta molekuly vody, methanu, oxidu uhelnatého a retro-Diels-Alderovské (RDA) štěpení. Na experimentálně získaná data navazuje studie využívající výpočetní metody (DFT), pomocí kterých je studována energetická stabilita studovaných fragmentů. Bylo zjištěno, že fragmentový ion má vyšší intenzitu v MS/MS spektru toho izomeru, pro který má nižší vypočtenou energii (je stabilnější). Ztráta vody, methanu a dvou molekul oxidu uhelnatého je tak preferována u 5-methylpyranopelargonidinu, zatímco RDA štěpení u 4-methylfuranopelargonidinu. U 5-methylpyranopelargonidinu byla provedena také podrobnější studie zkoumající kinetickou preferenci štěpení molekuly oxidu uhelnatého a molekuly vody. Závěry ukazují, že výpočetní metody jsou užitečným nástrojem při odhalování rozdílu ve fragmentačním chování derivátů anthokyaninů včetně izomerních barviv. Poslední část práce se zabývá přípravou a analýzou ovocného (jahodového) vína. V připraveném víně jsou s využitím UHPLC/MS detekovány anthokyaniny a jejich deriváty a je studována změna obsahu vybraných anthokyaninů během procesu kvašení. V jahodovém víně byly nalezeny mimo jiné i studované izomery (5-methylpyranopelargonidin a 4-methylfuranopelargonidin), které tak byly vůbec poprvé detekovány v potravinovém produktu.

Abstract:

The dissertation thesis deals with the study of fragmentation behaviour of condensed anthocyanins in the collision cell of a mass spectrometer. The theoretical part of the thesis is devoted to an overview of condensed anthocyanin derivatives with detailed discussion of pyranoanthocyanins and furoanthocyanins, to possibilities of study of fragmentation behaviour using mass spectrometry and to computational methods in chemistry and their utilization in tandem MS analysis. The first part of the thesis deals with semisynthesis of two new isomeric anthocyanin dyes 5-methylpyranopelargonidin and 4-methylfuranopelargonidin by the reaction of pelargonidin with acetone. Changes of content of both isomers in time were studied and when sufficient yield of both derivatives was obtained, the dyes were isolated from the reaction mixture using a semipreparative LC method developed for this purpose. Identity of isolated compounds was verified using NMR. The second part of the thesis is devoted to the development of a fast chromatographic method to separate both derivatives and the native anthocyanin pelargonidin. A gradient UHPLC/MS method was developed using reversed stationary phase and simple aqueous-organic mobile phases. It allows to separate target compounds in less than 1 minute. An isocratic UHPLC/PDA method was developed as well to be used in instruments without the possibility of MS detection. The third part of the thesis studies fragmentation behaviour of isolated pelargonidin derivatives in MS/MS and compares their fragmentation spectra. Both compounds provide identical fragments, however their relative intensities differ and based on these differences both compounds can be distinguished. Important examined fragmentation processes involve loss of a water molecule, loss of methane molecule, loss of carbon monoxide and retro-Diels-Alder (RDA) fission. Experimentally obtained data are followed by a computational study using DFT methods aimed to investigate the energetic stability of studied fragments. It was found that a fragment ion has higher relative intensity in the MS/MS spectrum of that isomer, for which the energy of the fragment ion is lower (i.e. the fragment is more stable). Losses of water, methane and two moleclues of carbon monoxide are preferred in 5-methylpyranopelargonidin, while RDA fission is preferred in 4-methylfuranopelargonidin. For 5-methylpyranopelargonidin a detailed study investigating kinetic preference of carbon monoxide and water fission was performed. The results show that computatinal methods are a valuable tool to assess differences in fragmentation behaviour of anthocyanin derivatives including isomeric dyes. The final part of the thesis deals with preparation and analysis of a fruit (strawberry) wine. Anthocyanins and their derivatives were detected in prepared wine using UHPLC/MS and change of content of selected anthocyanins during the fermentation process was studied. Apart from other derivatives, studied dyes (i. e. 5-methylpyranopelargonidin a 4-methylfuranopelargonidin) were detected in strawberry wine which is the first mention of their detection in a food product.

Keywords

pyranoanthokyaniny, furanoanthokyaniny, pelargonidin, kapalinová chromatografie, hmotnostní spektrometrie, fragmentace, tandemová MS, fermentace, DFT, výpočetní chemie

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 10. 5. 2017

Thesis defence

• Supervisor: doc. RNDr. Petr Bednář, Ph.D.

PALACKÝ UNIVERSITY OLOMOUC

Faculty of Science

Doctoral programme / field:
Chemistry / Analytical Chemistry