Klonování a exprese proteinů

Mgr. Jan Škerle

Bachelor's thesis

Cloning and protein expression

Abstract:

Bakalářská práce se zaměřuje na expresi konstruktu proteinu Air2 (5 zinkových domén) v kvasince Pichia pastoris. Protein Air2 je součástí komplexu zvaného TRAMP, jehož funkcí je připojování dlouhých poly(A) konců během procesu kontroly kvality RNA. Tyto konce slouží jako signál pro další supramolekulární komplex zvaný exosom. Protein Air2 je pravděpodobně zodpovědný za rozpoznání vadných molekul a za navázání komplexu TRAMP na vlákno RNA. K tomuto navázání slouží patrně 5 zinkových domén, které jsou součástí exprimovaného konstruktu. Nejdříve byla zkoušena exprese konstruktu proteinu Air2 v bakterii E. coli, protein se však nepodařilo získat v solubilní formě. Proto bylo přikročeno k expresi v eukaryotním organismu - kvasince Pichia pastoris. Výhodou exprese v Pichia pastoris je jednak její pokročilý aparát pro posttranslační úpravy proteinů a dále její schopnost extracelulární exprese, čímž se značně zjednodušuje jejich následná purifikace. Nevýhodou je pak častá hyperglykosylace heterologních proteinů. Ze stanovených cílů se podařilo dosáhnout jen některých. Byl vytvořen vektor nesoucí gen pro konstrukt proteinu Air2, správnost zaklonování byla ověřena sekvenací. Tento vektor byl pomocí elektroporace úspěšně transformován do P. pastoris, což bylo potvrzeno jednak nárůstem kolonií na selekčních zeocinových plotnách a následně potom pomocí PCR screeningu vybraných kolonií. Pokusy o expresi konstruktu proteinu Air2 však zatím nebyly úspěšné. Ze zkoumaných kolonií exprimovala protein do media pouze jedna. Tento protein byl dále zkoumán ve snaze potvrdit, zda se jedná o Air2. Ani po deglykosylaci a následném měření na MS se jej však nepodařilo detekovat a tedy ani identifikovat.

Abstract:

Bachelor thesis focuses on the expression of protein construct Air2 in the yeast Pichia pastoris. Air2 is a part of TRAMP complex which function is to add long poly(A) tails during the process of RNA quality control. These poly(A) tails are instrumental in targeting to another supramolecular complex called the exosome. Air2 is probably responsible for the recognition of defective molecules and for the RNA recruitment to the TRAMP complex. RNA binding of Air2 is mediated by five zinc knuckles that are studied in this thesis. First, the expression of protein construct Air2 was tested in bacteria E. coli. However, expressed proteins were repeatedly obtained in insoluble form and protein refolding was unsuccessful. Thereby the eukaryotic organism – yeast Pichia pastoris – was used as an expression system. Gene construct of Air2 was successfully cloned into the vector and its validity was verified via sequencing. This vector was then successfully transformed in P. pastoris by electroporation which was confirmed by growth of colony on selective zeocine plates and also by PCR screening of selected colonies. Experiments with Air2 construct expression are currently underway. So far only one of selected colonies expressed the protein after induction, but its identity as Air2 construct was not confirmed by mass spectroscopy

Keywords

Kontrola kvality RNA v jádře, TRAMP komplex, Air2 protein, exosom, expresní systém Pichia pastoris

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 14. 5. 2009

Thesis defence

• Date of defence: 16. 6. 2009
• Supervisor: doc. Mgr. Richard Štefl, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Science

Bachelor programme / field:
Biochemistry / Biochemistry