Příprava thylakoidních membrán jehličnanů pro nativní elektroforetickou separaci pigment-proteinových komplexů

Pavlína HÝLOVÁ

Bachelor's thesis

Preparation of thylakoid membranes from conifer species for purposes native electrophoretic separation of pigment-protein complexes

Abstract:

Cílem mé bakalářské práce bylo provést izolaci thylakoidních membrán (tBM) jehličnanů s koncentrací celkových chlorofylů (Chl a+b) minimálně 1000 ?g chlorofylů v 1 ml výsledné suspenze tBM. Dále provést různé způsoby solubilizace tBM za použití několika typů detergentů a najít vhodný postup pro potřeby nativní elektroforetické separace pigment-proteinových komplexů (PPC) jehličnanů. Funkční stav izolovaných tBM byl také posuzován pomocí fluorescenčního parametru maximální fotochemické účinnosti fotosystému II (FV/FM). Izolace tBM byla provedena na jehlicích smrku ztepilého (Picea abies [L.] Karst) podle dvou metodik. K izolaci tBM jsem použila sazenice (stáří 6 let) a semenáčky (stáří 20 dní) smrku ztepilého. Mnou provedené izolace tBM z obou typů rostlinného materiálu vykazovaly vyšších hodnot parametrů FV/FM než uvádějí práce dosud provedené na katedře fyziky. Pokles FV/FM na výsledné suspenzi tBM byl v rozmezí 9-26,5% oproti hodnotě FV/FM stanovené na intaktním rostlinném materiálu. Úspěšné izolace tBM z hlediska požadovaného množství celkových chlorofylů ve výsledné suspenzi tBM bylo dosaženo za použití semenáčků a upravené metodiky Noska (2012) (výsledná koncentrace chlorofylu a+b byla 1072,65 ?g/ml a 1753 ?g/ml). K solubilizaci tBM byly použity čtyři typy detergentů: Triton X-100, n-dodecyl-?-D-maltosid (?-DM), n-dodecyl-?-D-maltosid (?-DM) a n-hexadecyl-?-D-maltopyranosid (?-HDM) v různých hmotnostních poměrech detergent:chlorofyl. Pro separaci PPC byla zvolena metoda bezbarvé nativní elektrorézy (CN-PAGE). Nejlepších výsledků bylo dosaženo za použití detergentu ?-DM a ?-DM při nízkých poměrech detergent:chlorofyl, tj. 30:1, 40:1 a 50:1. Pomocí CN-PAGE došlo k separaci superkomplexů PSII-PHCII, PSI a PSII bez připojených světlosběrných komplexů, trimeru LHCII, monomeru LHCII a volných pigmentů.

Abstract:

The aim of my bachelor thesis was isolate thylakoid membranes (tBM) of conifers with concentration of total chlorophyll (Chl a+b) at least 1000 ?g chlorophylls in 1 ml of final suspension of tBM. Further perform different ways of the solubilization of tBM by using several types of detergents and find a suitable procedure for the needs of the native electrophoretic separation of pigment-protein complexes (PPC) of conifers. The functional quality of the isolated tBM was also assessed by fluorescence parameter of maximum photochemical efficiency of photosystem II (FV/FM). Isolation of the tBM was realized on the needles of Norway spruce (Picea abies [L.] Karst) by two methods. I used 6 years old trees and 20 days old seedlings of Norway spruce to isolate the tBM. My isolation of tBM from both types of plant material showed higher values of the parameter FV/FM than works carried out at the Department of Physics. The decrease of the parameter FV/FM of the resulting suspension was in the range of 9-26,5% compared with intact plant material. Successful isolation of tBM was achieved by using seedlings and modified methodology of Nosek (2012) (final concentration of the chlorophyll a+b was 1072,65 ?g/ml and 1753 ?g/ml). Four types of detergents were used to solibilize tBM: Triton X-100, n-dodecyl-?-D-maltosid (?-DM), n-dodecyl-?-D-maltosid (?-DM) and n-hexadecyl-?-D-maltopyranosid (?-HDM) in various weight ratios of detergent:chlorophyll. Colorless native electrophoresis (CN-PAGE) were chosen for the separation of PPC. The best results were achieved by using a detergent ?-DM and ?-DM at low ratios of detergent:chlorophyll (i.e. 30:1, 40:1 and 50:1). A separation of supercomplexes PSII-LHCII, PSI and PSII without connected lightharvesting complexes, trimeric forms of LHCII, monomeric form of LHCII and free pigments were achieved by using CN-PAGE.

Keywords

izolace thylakoidních membrán, fluorescenční parametr FV/FM, pigment-proteinové komplexy, solubilizace, CN-PAGE, smrk ztepilý

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 23. 4. 2014

Accessible from:: 23. 4. 2014

Thesis defence

• Date of defence: 19. 5. 2014
• Supervisor: Mgr. Irena Kurasová, Ph.D.

University of Ostrava

Faculty of Science

Bachelor programme / field:
Biology / Experimental Biology