Heterologní exprese a studium isopentenyltransferas z modelového mechu Physcomitrella patens

Jakub SAVARA

Diplomová práce

Heterologous expression and characterization of isopentenyl transferases from model plant Physcomitrella patens

Anotace:

Mech Physcomitrella patens je modelový organismus patřící z fylogenetického hlediska mezi vývojově staré organismy. V posledních letech vzrostl zájem o jeho využití pro základní výzkum, k čemuž přispěl zejména osekvenovaný genom a možnost využití moderních metod jako RNA interference nebo CRISPR/Cas9. Jeho růst a vývoj je kontrolován především evolučně starými fytohormony cytokininy, auxiny a kyselinou abscisovou. Genom tohoto mechu kóduje pouze homology pro tRNA-IPT, klíčový enzym cytokininové biosyntetické dráhy, která pravděpodobně není významným zdrojem aktivních volných cytokininů v kvetoucích rostlinách. Současné poznatky naznačují, že tato dráha je klíčovou pro biosyntézu aktivních cytokininů ve Physcomitrella patens, současně je však pravděpodobná existence i druhé, tRNA-nezávislé dráhy. Tato dráha se zdá důležitá v produkci aktivních cytokininů v Physcomitrella patens, a tak je žádoucí podrobný výzkum ostatních šesti IPT genů tohoto mechu. Tato práce je zaměřena na heterologní produkci IPT z tohoto mechu s využitím E. coli a ověření jejich funkčnosti k různým substrátům. V rámci práce byly také připraveny binární konstrukty pro expresi proteinů PpIPT1, 3, 4 a 6 in planta. Tyto konstrukty budou v budoucnu využity pro infiltraci do listů tabáku (Nicotiana bentamiana) a k transformaci rostlin Arabidopsis thaliana Col0 metodou floral-dip.

Abstract:

The moss Physcomitrella patens is a model organism that belongs phylogenetically to evolutionarily ancient organisms. The interest in the use of this moss for basic research grew in the last years, mostly due to the known genome sequence and the possibility of use of modern methods such as RNA interference or CRISPR/Cas9. Its growth and development are controlled predominately by evolutionarily old phytohormones cytokinins, auxins, and abscisic acid. The genome of this moss encodes only homologues for tRNA-IPT, a key enzyme of the cytokinin biosynthetic pathway, which is likely not an important source of active free cytokinins in higher plants. Recent knowledge suggests that this pathway is crucial for the biosynthesis of active cytokinins in Physcomitrella patens, however, there exists, probably also a second, tRNA-independent pathway. This putative pathway seems to be important for the production of active cytokinins in Physcomitrella patens, so the detailed research of the remaining IPT family members in this moss is of great importance. This work focuses on the heterologous production of Physcomitrella IPTs in E. coli and on the verification of their functionality with various substrates. Binary plasmid constructs for the in planta expression of PpIPT1, 3, 4, and 6 have been prepared. These constructs will be used for the infiltration of tobacco leaves (Nicotiana bentamiana) and the transformation of Arabidopsis thaliana Col0 plants using the floral-dip method in near future.

Klíčová slova

isopentenyltransferasa, IPT tRNA, cytokinin, biosyntéza, Physcomitrella patens

Jazyk práce: čeština

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 28. 4. 2017

Obhajoba závěrečné práce

• Vedoucí: Mgr. David Zalabák, Ph.D.

UNIVERZITA PALACKÉHO V OLOMOUCI

Přírodovědecká fakulta

Magisterský studijní program / obor:
Biochemie / Biochemie