Identifikace a mapování genů na pohlavních chromozomech Silene latifolia

Mgr. Martin Košař

Diplomová práce

Identification and mapping of genes on the sex chromosomes of Silene latifolia

Anotace:

Dvoudomá rostlina silenka širolistá (Silene latifolia) s XX/XY systémem determinace pohlaví představuje vhodný modelový organismus pro studium evoluce pohlavních chromozomů. Cílem předložené diplomové práce bylo: 1) strukturně a funkčně charakterizovat gen X1G5, 2) izolovat a charakterizovat nové sekvence z pohlavních chromozomů S. latifolia, 3) provést komparativní cytogenetickou studii u druhů S. latifolia a S. vulgaris.V první části byl charakterizován gen X1G5 nově izolovaný v naší laboratoři. Tento gen je vázaný na X chromozom S. latifolia a na proteinové úrovni vykazuje vysokou homologii k proteinu kódovaného genem HVA22F s neznámou funkcí u A. thaliana. Subklonováním BAC klonu obsahujícího gen X1G5 se podařilo jak částečně stanovit sekvenci nekódující části genu vykazující intronový polymorfismus, tak i získat informaci o okolí tohoto genu. Výsledky expresní studie ukazují, že studovaný gen pravděpodobně hraje roli při vývoji poupat. Při studiu funkce X1G5 byl použit přístup založený na využití T-DNA inzerčních mutantů A. thaliana v homologním genu HVA22F. Druhá část práce byla zaměřena na izolaci a charakterizaci nových sekvencí z pohlavních chromozomů S. latifolia. Po prohledání (screening) BAC knihovny pomocí sond odvozených ze sekvence dříve publikovaných genů SlssX a DD44Y byly vybrány dva BAC klony, jež byly následně subklonovány. Po stanovení počtu kopií vybraných subklonů byla u málo četných sekvencí v genomu provedena RT-PCR, zatímco repetitivní sekvence byly charakterizovány pomocí FISH. Touto metodikou se podařilo izolovat dva nové geny s označením D01 a G01 vázané na pohlavní chromozomy S. latifolia. Jelikož do současné doby bylo obdobných genů v literatuře publikováno pouze 11, jeví se námi zvolený metodický přístup jako vysoce efektivní. Oba geny jsou exprimovány především v poupatech obou pohlaví a představují potenciální kandidáty pro studium mechanismu dávkové kompenzace u rostlin. Dále byl v konkrétních BAC klonech odvozených z X a Y chromozomů nalezen dříve popsaný Ty3- gypsy retroelement. Tato unikátní repetice vykazuje rovnoměrnou distribuci na autozomech a X chromozomu, zatímco na chromozomu Y se vyskytuje pouze v pseudoautozomální oblasti. Tato data mohou v budoucnu umožnit získat informaci nejen o jejím cílovém místě inzerce, vztahu ke genům, ale především objasnit způsob šíření v rámci genomu S. latifolia. Ve třetí části byla provedena komparativní cytogenetická studie založená na fluorescenční in situ hybridizaci vybraných BAC klonů s chromozomy S. latifolia a S. vulgaris. Jednotlivé příklady ukazují jednak obdobnou distribuci některých repetitivních sekvencí v rámci jednotlivých genomů, ale i repetice, které nejsou přítomny v genomu S. latifolia, avšak jsou vysoce abundantní u S. vulgaris. Výsledky třetí části se v blízké budoucnosti stanou součástí projektu, který se bude zabývat evolucí velikosti genomů v rámci rodu Silene.

Abstract:

White campion (Silene latifolia), a dioecious plant with XX/XY sex determination system, represents a suitable model organism to study sex chromosome evolution. The main aims of thesis were: 1) structural and functional characterization of X1G5 gene, 2) isolation and characterization of new sequences from S. latifolia sex chromosomes, 3) comparative cytological study of S. latifolia and S. vulgaris species.In the first part, we have characterized X1G5 gene which was recently isolated in our laboratory. This gene is linked to X chromosome of S. latifolia and reveals high similarity to Arabidopsis thaliana HVA22F gene with unknown function. Sub-cloning of selected BAC clone containing X1G5 gene enabled us to characterize the non-coding part of the gene. Moreover, we acquired information about flanking region and intron polymorphism of different alleles. The expression study showed that the gene probably plays a role in flower-bud development. To perform reverse genetics approach, we have employed T-DNA A. thaliana insertion mutant for homologous gene HVA22F. The second part of my thesis was focused on isolation and characterization of new sequences from sex chromosomes of S. latifolia. After screening genomic BAC library using gene-specific probe derived from a sequence of previously published genes SlssX and DD44Y, we have selected two BACs, which were subsequently sub-cloned. In order to identify new genes we carried out RT-PCR experiments with “low-copy” sequences, while repetitive sequences were characterized by FISH. Finally, we found two new genes, D01 and G01, linked to sex chromosomes of the S. latifolia. Since only 11 sex linked genes are known from literature so far, we can consider our approach as very efficient in terms of quantity of identified genes. Our new genes are expressed mainly in flower-buds of both genders and represent potential candidates to study mechanisms of dosage compensation in plants. Moreover, Ty3-gypsy retrotransposon described in previous study was identified in BAC clones derived from X and Y chromosomes of S. latifolia. This unique repetitive element is very common on autosomes and X chromosome, but is present only in pseudoautosomal region on the Y chromosome. These data could help us not only to understand mechanisms of the element spreading but its targeting in genome with respect to sex chromosome evolution as well. Third part was focused on comparative cytogenetics experiments between S. latifolia and S. vulgaris genomes based on fluorescence in situ hybridization with selected BAC clones. We present examples of similar distribution of some repetitive sequences in individual genomes. On the other hand, we found several markers rather rare in S. latifolia, but very abundant in S. vulgaris. Results of this part of thesis will be included in project focusing on genome size evolution in genus Silene.

Klíčová slova

Silenka širolistá, pohlavní chromozomy, dvoudomost, repetitivní sekvence, Silene latifolia, sex chromosomes, dioecy, repetitive sequences

Jazyk práce: čeština

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 15. 5. 2008

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 16. 6. 2008
• Vedoucí: RNDr. Roman Hobza, Ph.D.

Masarykova univerzita

Přírodovědecká fakulta

Magisterský studijní program / obor:
Biologie / Molekulární biologie a genetika