Studium beta-sekretázové reakce pomocí moderních elektromigračních metod

Bc. Šárka Šefraná

Master's thesis

Study of beta-secretase reaction by means of modern electromigration methods

Abstract:

Tato diplomová práce se věnuje studiu β-sekretázy, tedy enzymu, jehož činnost podle obecně přijímané amyloidové teorie vede k rozvoji Alzheimerovy choroby. Tato proteáza produkuje 40 až 42 aminokyselin dlouhé nerozpustné fragmenty, které polymerují a vytvářejí amyloidové plaky, které se ukládají v mozkové tkáni a způsobují zánětlivé reakce s následným odumíráním neuronů. Předložená studie navazuje na práci, která se zabývala zavedením metody pro kinetické studie tohoto enzymu, v rámci které byly optimalizovány podmínky inkubace enzymové reakce s modelovým substrátem v off-line uspořádání. Hlavním cílem této práce bylo zajištění možnosti opakovatelného použití enzymu a zvýšení jeho stability, k čemuž byla využita technika imobilizace na magnetické mikročástice pomocí kovalentní vazby. Pro analýzu produktů reakce byla zvolena kapilární elektroforéza ve spojení s hmotnostní spektrometrií, která je díky vysoké separační účinnosti a minimální spotřebě vzorků, vhodná pro studium finančně nákladných enzymů. V praktické části této práce tak byly optimalizovány podmínky pro navázání enzymu s cílem zajištění co možná nejvyšší aktivity a stability. Dále byly optimalizovány podmínky inkubace enzymové reakce v off-line uspořádání. Zavedená metoda byla následně částečně validována a použita ke kinetické studii imobilizované beta-sekretázy.

Abstract:

This thesis deals with study of β-secretase, the enzyme on whose activity the amyloid theory of Alzheimer´s disease is based. This protease produces 40 - 42 long insoluble amino acid fragments which polymerize and create amyloid plaques that deposit in a brain tissue and cause inflammatory reactions with neurons necrosis as its consequence. The presented study extends a previous work which was focused on development of a method for kinetic studies of this enzyme. In the groundword, incubation conditions of β-secretases´s reaction with a model substrate in off-line arrangement were optimized. The main aim of this thesis was to enable a repeated use of the enzyme and increase its stability. Immobilization on magnetic microparticles via covalent bonds was used for this purpose. Analyses of reaction products were carried out on capillary electrophoretic system coupled with mass spectrometry. Due to its high separation efficiency and minuscule sample consumption this hyphenated technique represents a promising tool for studies of expensive enzymes. In practical part of this thesis immobilization conditions were optimized with respect to assuring high enzyme activity and stability. Incubation conditions of enzyme reaction in the off-line arrangement were also optimized. The final method was consequently partly validated and used for kinetic study of immobilized β-secretase.

Keywords

Beta-sekretáza, Alzheimerova choroba, imobilizace, magnetické mikročástice, kapilární elektroforéza, hmotnostní spektrometrie, Beta-secretase, Alzheimer´s disease, immobilization, magnetic microparticles, capillary electrophoresis, mass spectrometry

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 10. 5. 2016

Thesis defence

• Date of defence: 1. 6. 2016
• Supervisor: prof. RNDr. Zdeněk Glatz, CSc.

Masaryk University

Faculty of Science

Master programme / field:
Biochemistry / Analytical Biochemistry