Molekulární mechanismy gluko- a lipotoxicity u diabetu: role v patogenezi diabetických komplikací

Mgr. Veronika Dvořáková, Ph.D.

Doctoral thesis

Molecular mechanisms of gluco- and lipotoxicity in diabetes: role in the pathogenesis of diabetic complications

Abstract:

Úvod. Na rozvoji diabetických komplikací včetně diabetické nefropatie (DN) se podílejí molekulární mechanizmy souborně nazývané jako gluko- a lipotoxicita jejichž efekt je tím větší čím horší je kompenzace diabetu. Interindividuální variabilita v rychlosti nástupu a tíži komplikací u podobně kompenzovaných diabetiků nicméně naznačují existenci potenciálně protektivních procesů. Domníváme se, že jimi mohou být jednak biochemické dráhy potenciálně snižující rozsah glykace, tj. pentózový cyklus, glyoxalázový systém a fruktózaminová dráha, a rovněž faktory ovlivňující biogenní dostupnost oxidu dusnatého, tj. aktivita endoteliální syntázy oxidu dusnatého (eNOS) a poměr mezi jejím substrátem (L arginin) a inhibitory (symetrický [SDMA] a asymetrický dimethylarginin [ADMA]). Metody. U prospektivně sledované kohorty diabetiků 1. a 2. typu (n=407, sledováni po dobu mediánu 39 měsíců) s variabilním stupněm poškození ledvin byl hodnocen vliv genetických a biochemických markerů ve vztahu k potenciálně protektivním procesům v podmínkách gluko- a lipotoxicity na následující klinické události: i) progresi DN, ii) závažnou kardiovaskulární událost (nefatální nebo fatální) a iii) celkovou mortalitu. Celkem 26 jednonukleotidových polymorfizmů v genech pro transketolázu (TKT), transketolázu-like 1, transaldolázu, glukóza-6-fosfát dehydrogenázu, glyoxalázu, fruktózamin-3 kinázu (FN3K), eNOS a dimethylarginin dimethylaminohydrolázu bylo stanoveno pomocí polymerázové řetězové reakce a restrikční analýzy nebo pomocí TaqMan® sond. Hladiny L argininu, SDMA a ADMA, thiaminu a jeho esterů byly měřeny pomocí vysoce účinné kapalinové chromatografie. Aktivita TKT byla hodnocena kinetickou metodou. Efekt uvedených parametrů na výskyt událostí v čase byl hodnocen metodami založenými na „time-to-event“ analýzách. Výsledky. Snížená intracelulární dostupnost aktivního kofaktoru TKT – thiamin difosfátu - má vztah ke zvýšené mortalitě diabetiků (p<0,001; Kaplan-Meierova analýza). Genetická variabilita v TKT (rs11130362, rs3736156) a částečně i v FN3K (rs1056534) byla asociována s progresí DN (p=0,006; Kaplan-Meierova analýza) a se závažnou kardiovaskulární událostí (p=0,010; Kaplan-Meierova analýza). Methylované argininy (ADMA, SDMA a poměr L-arginin/ADMA) standardizované na glomerulární filtrační rychlost se ukázaly jako vhodné biomarkery progrese DN (p<0,005; model Fineho a Graye). Polymorfizmus v genu pro eNOS (rs1799983) byl asociován s progresí DN (p<0,023; Coxův model proporcionálních rizik) a se závažnou kardiovaskulární událostí (p<0,036; Coxův model proporcionálních rizik). Závěr. Prokázali jsme vztah některých studovaných potenciálně protektivních procesů k míře poškození způsobeném gluko- a lipotoxickými mechanizmy u diabetiků a rovněž jejich těsnou závislost na stupni poškození ledvin.

Abstract:

Background. Molecular mechanisms collectively termed as gluco- and lipotoxicity are responsible for the development of diabetic complications including diabetic nephropathy (DN) in an extent corresponding to the level of metabolic compensation of the disease. Interindividual variability in the rate of onset and the severity of complications in diabetic patients with similar compensation however suggests the occurrence of potentially protective processes. We believe that biochemical pathways potentially reducing the extent of glycation, i.e. pentose phosphate, glyoxalase and fructosamine pathway, and also factors affecting availability of nitric oxide, i.e. the activity of endothelial nitric oxide synthase (eNOS) and the ratio between levels of its substrate (L-arginine) and inhibitors (symmetric [SDMA] and asymmetric dimethylarginine [ADMA]) are potential candidates. Methods. The cohort of type 1 and type 2 diabetics (n=407) with variable degree of renal impairment was prospectively followed for a median of 39 months. We evaluated the effect of relevant genetic and biochemical markers on following clinical events: i) progression of DN, ii) major cardiovascular event (non-fatal or fatal), and iii) all-cause mortality. A total of 26 single nucleotide polymorphisms in the genes for transketolase (TKT), transketolase-like 1, transaldolase, glucose-6-phosphate dehydrogenase, glyoxalase, fructosamine-3 kinase (FN3K), eNOS, and dimethylarginine dimethylaminohydrolase were genotyped using the polymerase chain reaction and restriction analysis or using TaqMan® probes. Levels of L-arginine, ADMA, SDMA, thiamine and its esters were measured by high performance liquid chromatography. TKT activity was assessed by the kinetic method. The effect of these parameters on the occurrence of events in time has been evaluated by methods based on the time-to-event analysis. Results. Our results showed that the decreased intracellular availability of active TKT cofactor - thiamine diphosphate - is related to increased diabetic mortality (p<0.001; Kaplan-Meier analysis). Genetic variability in TKT alone (rs11130362, rs3736156) and in combination with FN3K (rs1056534) was associated with the progression of DN (p=0.006; Kaplan-Meier analysis) and the major cardiovascular event (p=0.010; Kaplan-Meier analysis). Methylated arginines (ADMA, SDMA and ratio L arginine/ADMA) standardized to glomerular filtration rate have been proved as valid biomarkers of DN progression (p<0.005; Fine and Gray model). Polymorphism in the eNOS gene (rs1799983) was associated with the progression of DN (p<0.023; Cox proportional model) and the major cardiovascular event (p<0.036; Cox proportional model). Conclusions. We have proved the association of some of the studied potentially protective processes with the extent of damage caused by gluco- and lipotoxicity mechanisms in diabetic patients as well as their close dependence on the degree of renal impairment.

Keywords

diabetes mellitus, diabetická nefropatie, fruktózaminová dráha, genetická variabilita, glukotoxicita, glyoxalázový systém, lipotoxicita, oxid dusnatý, pentózový cyklus

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 2. 6. 2014

Thesis defence

• Date of defence: 20. 6. 2014
• Supervisor: prof. MUDr. Kateřina Kaňková, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Medicine

Doctoral programme / field:
Physiology and Pathological Physiology (4-years) / Physiology and Pathological Physiology