Konštrukcia a charakterizácia mutantných foriem cytokinínového receptoru CRE1 / AHK4 z Arabidopsis thaliana

Marika Pacurová

Bachelor's thesis

Konstrukce a charakterizace mutantních forem cytokininového receptoru CRE1 / AHK4 Arabidopsis thaliana

Abstract:

Rostlinný receptor CRE1 / AHK4 vytváří po navázání cytokininů signál, který je následně přenášený do jádra buňky, kde reguluje transkripci cílových genů. Pro studium aktivity receptoru a jeho mutantních forem se využívá skutečnosti, že receptor zachovává svou aktivitu i po expresi v kmeni KMI001 bakterie Escherichia coli, kdy je detekovaná aktivita β-galaktozidázy jako odpověď na cytokininy. Práce ,,Konstrukce a charakterizace mutantních forem cytokininového receptoru CRE1/AHK4 z Arabidopsis thaliana“ rozebírá problematiku mutageneze vykonané pomocí komerčně dostupného kitu a postupu popsaného v odborné literatuře. Současně charakterizuje receptor AHK4, popisuje jeho signální dráhu po expresi v bakteriálním kmeni KMI001 a shrnuje také jeho popsané mutantní formy. Experimentální část se zaměřuje na PCR mutagenezi vykonanou dvěma popsanými způsoby včetně návrhu primerů zanášejících mutaci a transformaci mutovaného konstruktu do Escherichia coli KMI001. Dále se zaměřuje na samotný test β-galaktosidázové aktivity mutantních variant CRE1 / AHK4 v přítomnosti koncentrační řady hormonu trans-zeatinu. Výsledky ukazují, že mutace L437F, L437G, L437I, L437W a L437Y způsobují při nízkých koncentracích trans-zeatinu zvýšenou míru aktivity vůči původní nemutované formě CRE1 / AHK4 receptoru, avšak přítomnost mutace L437H způsobila ztrátu této aktivity.

Abstract:

The CRE1 / AHK4 plant receptor produces after cytokinin binding a signal transferred to the cell nucleus where it regulates the transcription of target genes. The functionality of the receptor is retained after expression in the Escherichia coli KMI001 which is then used for the study of the receptor, where ß-galactosidase activity is detected in response to cytokinins. The "Construction and Characterization of Arabidopsis thaliana CRE1 / AHK4 Cytokinin Receptor Mutant Forms" describes the principle of mutagene-sis of a commercially available kit and approach published in the literature, summarizes the function of the AHK4 receptor, describes its signal pathway after expression in the bacterial strain KMI001 and characterizes its mutant forms. The experimental part focuses on the PCR mutagenesis carried out by the two methods including the design of mutagenic primers containing the desired mutation and performing the transformation of the mutant construct into Escherichia coli strain KMI001, as well as the β-galactosidase activity test of the mutant variants CRE1 / AHK4 receptor in the presence of the trans-zeatin hormone concentrations. The results indicate that mutations L437F, L437G, L437I, L437W and L437Y cause increased activity at low level of the trans-zeatin concentrations compared to wild-type CRE1 / AHK4 receptor, but the effect of the L437H mutation causes loss of this activity.

Abstract:

Rastlinný receptor CRE1 / AHK4 vytvára po naviazaní cytokinínu signál, ktorý je následne prenášaný do jadra bunky, kde reguluje transkripciu cieľových génov. Pre štúdium aktivity receptora a jeho mutantných foriem je využívaná skutočnosť, že receptor zachováva svoju aktivitu aj po expresii v kmeni KMI001 baktérie Escherichia coli, kedy je detegovaná aktivita β-galaktozidázy ako odpoveď na cytokiníny. Práca „Konštrukcia a charakterizácia mutantných foriem cytokinínového receptoru CRE1 / AHK4 z Arabidopsis thaliana“ rozoberá problematiku mutagenézy vykonanej pomocou komerčne dostupného kitu a postupu opísaného v odbornej literatúre. Súčasne charakterizuje receptor AHK4, popisuje jeho signálnu dráhu po expresii v bakteriálnom kmeni KMI001 a zhrňuje tiež jeho opísané mutantné formy. Experimentálna časť sa zameriava na PCR mutagenézu vykonanú dvoma popísanými spôsobmi vrátane návrhu primerov zanášajúcich mutáciu a transformáciu mutovaného konštruktu do Escherichia coli KMI001. Ďalej sa zameriava na samotný test aktivity mutantných variantov receptora CRE1 / AHK4 v prítomnosti koncentračného radu hormónu trans-zeatínu. Výsledky uka-zujú, že mutácie L437F, L437G, L437I, L437W a L437Y spôsobujú pri nízkych koncentráciách trans-zeatínu zvýšenú mieru aktivity voči pôvodnej nemutovanej forme CRE1/AHK4 receptora, avšak prítomnosť mutácie L437H spôsobila stratu tejto aktivity.

Keywords

kmen KMI001 Escherichia coli, trans-zeatin, PCR mutageneze, β-galaktosidázová aktivita, AHK4

Keywords

β-galactosidase activity, Escherichia coli KMI001 strain, AHK4, PCR mutagenenesis, trans-zeatin

Keywords

AHK4, β-galaktozidázová aktivita, PCR mutagenéza, trans-zeatín, kmeň KMI001 Escherichia coli

Language used: Slovak

Date on which the thesis was submitted / produced: 26. 4. 2018

Thesis defence

• Supervisor: Mgr. Dušan Turek

Mendel University in Brno

Faculty of AgriSciences

Bachelor programme / field:
Agrobiology / Molecular biology and biotechnology