Nové metody studia interakcí DNA s proteiny rodiny p53, založené na chemické modifikaci, fluorescenční a elektrochemické analýze

Mgr. Petr Orság, Ph.D.

Doctoral thesis

Novel methods of p53 protein-DNA interaction studies based on chemical modification, fluorescence and electrochemical analysis

Abstract:

V této práci jsou pro studium interakcí DNA s proteiny rodiny p53 prezentovány nové metodické postupy využívající fluorescenční značení nebo chemickou modifikaci DNA spojenou s elektrochemickou analýzou Jsou prezentovány koncepty, které pro přípravu značené DNA využívají enzymatickou inkorporaci modifikovaných deoxynukleotid trifosfátů. Jedná se o způsob, který nabízí vysokou flexibilitu značení, pokud jsou dostupné vhodné substráty pro polymerázy. Pomocí metody prodlužování primeru (PEX) byly připraveny DNA sondy nesoucí konjugované fluorofory v rámci p53 vazebné sekvence (p53CON). Zjistili jsme, že přítomnost modifikací v rámci p53CON neovlivňovala vazebné vlastnosti p53, přičemž interakce byla spojena s nárůstem fluorescence. Analogicky byly pomocí PEX připraveny značené DNA nesoucí reaktivní skupiny Michaelových akceptorů (MA). Pomocí cílené lokalizace MA v rámci p53CON byla testována schopnost vytvářet kovalentní kroslink s cysteiny, které se nachází blízko DNA nebo se podílejí na interakci s DNA. Přítomnost MA v rámci p53CON neovlivnila schopnost proteinu p53 vázat se specificky na DNA a docházelo k tvorbě stabilního konjugátu. Sekvenčně specifická biokonjugace byla potvrzena vazebnými experimenty s mutantními formami proteinu p53. Další studie byly zaměřeny na detekci protein-DNA interakcí pomocí kombinovaného přístupu, který využívá redoxní značení DNA, imunoprecipitaci a elektrochemickou detekci. Prostřednictvím specifických protilátek, z nichž některé mohou modulovat vazebnou afinitu p53, byla provedena imunoprecipitace komplexů protein-DNA. Detekce značených DNA byla provedena pomocí elektrochemických technik. DNA byla značena chemickou modifikací vybraných bází, při které vznikaly stabilní adukty. Vzniklé adukty byly při terminálním značení nespárovaných thyminů lokalizovány mimo p53CON. V případě značení DNA cisplatinou (CisPt) byly adukty lokalizovány vždy podél celé sekvence (vazebná místa pro CisPt i v rámci p53CON) nebo jen okolo p53CON (pokud došlo k eliminaci CisPt vazebných míst). Modifikovaná DNA poskytuje na povrchu rtuťových elektrod katalytické signály, což umožňuje stanovit značenou DNA s vysokou citlivostí. Dále byla sledována interakce proteinu p53 s jednotlivými značenými DNA, a zejména byla stanovena relativní vazebná afinita p53 pro různé DNA substráty při kompetičním uspořádání experimentů. Kromě elektrochemické detekce cisplatiny jako redoxní značky jsme se dále zabývali elektrochemickým chováním purinového analogu roskovitinu. Jedná se o látku, která vykazuje protinádorové účinky a její působení je spojeno s aktivací proteinu p53. Pomocí voltametrických technik jsme ukázali, že roskovitin podléhá na povrchu uhlíkových elektrod ireverzibilní oxidaci, kdy poskytuje analyticky využitelný signál v alkalickém pH. Pomocí dvou rozdílných typů uhlíkových elektrod jsme byli schopni stanovit (sub)mikromolární koncentrace nejen v samotných pufrech, ale zejména v kultivačním médiu.

Abstract:

In this work we present new methodical approaches for studying DNA interactions with p53 family proteins based on fluorescence labelling or chemical modification with electrochemical analysis. We present the concept of enzymatic incorporation of modified deoxynucleoside triphosphates for the preparation of labelled DNA. This method offers high labelling flexibility when suitable substrates for polymerases are available. Using the primer extension reaction (PEX), DNA probes carrying conjugated fluorophores within the p53 binding sequence (p53CON) were prepared. The presence of modifications within p53CON did not affect binding properties of p53 and the interaction was associated with increase in fluorescence. Analogous PEX labelled DNA carrying reactive moieties of Michael acceptors (MAs) were prepared. Using targeted MA localization within p53CON, the ability to form covalent crosslinks with cysteines close to DNA or in its close proximity was tested. The presence of MA within p53CON did not influence the p53 protein’s ability of the specific interaction and led to the formation of stable conjugates. Sequence specific bioconjugation was confirmed by binding experiments with mutant forms of the p53 protein. Further studies have concentrated on the detection of DNA-protein interactions through a combined approach using redox DNA labelling, immunoprecipitation and electrochemical detection. Using specific antibodies, some of which can modulate the binding affinity of p53, the precipitation of bound protein-DNA complexes was performed. After release of DNA from the complexes, the detection of bound labelled DNA by electrochemical techniques was performed. DNA labelling was performed by chemical modification of selected bases, which led to the formation of stable adducts. The resulting adducts were located outside the p53CON as a result of terminal labelling of unpaired thymines. In the case of cisplatin (CisPt) labelling, the adducts were either located along the entire sequence (CisPt binding sites within p53CON) or located only around p53CON (if the CisPt binding sites were eliminated). Their detection on the surface of mercury electrodes provides catalytic signals, enabling the determination of labelled DNA with high sensitivity. Interaction of the p53 protein with the individual labelled DNA probes was monitored, but in particular the relative binding affinity for the various DNA substrates was determined in the competition experiment. Besides the electrochemical detection of cisplatin as a redox probe, we have dealt with electrochemical behaviour of the purine analogue, roscovitine. It is a substance that shows antitumor effects and its action is also associated with activation of the p53 protein. Using voltammetric techniques, we have shown that roscovitine undergoes irreversible oxidation on the surface of carbon electrodes, providing an analytically usable signal at alkaline pH. Using two different types of carbon electrodes, we were able to determine (sub)micromolar concentrations not only in the buffers themselves, but especially in the culture medium.

Keywords

protein p53, fluorescence, solvatochromní fluorofory, molekulární rotory, biokonjugace, značení DNA, voltametrie, cisplatina, osmium, roskovitin, p53 protein, solvatochromic fluorophores, molecular rotors, bioconjugation, DNA labelling, voltammetry, cisplatin, roscovitine

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 12. 11. 2018

Thesis defence

• Date of defence: 12. 12. 2018
• Supervisor: doc. RNDr. Miroslav Fojta, CSc.
• Reader: doc. Ing. Tomáš Navrátil, Dr., doc. RNDr. Petr Pečinka, CSc.

Masaryk University

Faculty of Science

Doctoral programme / field:
Biochemistry (4-years) / Genomics and Proteomics