Metodické přístupy založené na PCR využitelné pro diagnostiku parazitárních infekcí alimentárního původu

Mgr. Lucie Škorpíková, Ph.D.

Doctoral thesis

PCR-based methodical approaches used for the diagnostics of parasitic infections of alimentary origin

Abstract:

V současnosti jsou celosvětově řešeným tématem infekce alimentární původu, které představují jedno z nejčastějších zdravotních rizik jak pro člověka, tak i pro zvířata, a které mnohdy vyúsťují v závažné sociálně-ekonomické problémy. Společným znakem těchto nákaz je vstup infekce do hostitelského organismu prostřednictvím gastrointestinálního traktu, přičemž k přenosu může docházet přímo fekálně-orální cestou nebo nepřímo příjmem živin a tekutin. Původců těchto infekcí existuje celá škála, nicméně mezi ty nejvíce opomíjené a podceňované patří jednobuněční a mnohobuněční parazité. Z globálního hlediska je největší pozornost věnována bezpečnosti potravin určeným k lidské spotřebě, což ale také souvisí se zdravím hospodářských i volně žijících zvířat, která mohou představovat významné zdroje těchto parazitárních infekcí. Vzhledem k nastávajícím změnám ovlivňujícím epidemiologii parazitických organismů, které jsou spojovány zejména s globalizací a změnou klimatu, je nutné zachovat ostražitost a pohotově do praxe zavádět vhodné kontrolní a preventivní postupy. Toho lze dosáhnout pouze v případě, kdy budou jednotně zavedeny vhodné diagnostické metody a nástroje, které budou rychlé, citlivé i spolehlivé a umožní rutinní a přesnou diagnostiku i monitorování těchto patogenů. Současný nedostatek takových přístupů je částečně způsoben omezenými finančními zdroji, jinými výzkumnými prioritami a částečně též obtížnou identifikací parazitů v různých matricích vzhledem k jejich složitým životním cyklům a různým mechanismům přenosu. Tato disertační práce se zaměřuje na možnosti moderních molekulárních metod a nástrojů a jejich dostupnost pro detekci a taxonomické odlišení významných parazitóz alimentárního původu, které by bylo možné pro využít v epidemiologii a ekologii parazitů i v otázkách bezpečnosti potravin. Práce se zabývá vývojem a optimalizací vhodných přístupů založených na PCR, které vychází z přímé detekce nukleových kyselin cílových patogenů. S ohledem na zaměření práce a využité metody byli za modelové organismy zvoleni medicínsky a/nebo veterinárně významní parazité lidí, hospodářských zvířat i volně žijících živočichů. Konkrétně se jedná o prvoka Toxoplasma gondii, hlístice rodu Trichinella a dále hospodářsky významné gastrointestinální hlístice přežvýkavců, kterými jsou například hematofágní hlístice druhů Haemonchus contortus a Ashworthius sidemi. Práce obsahuje teoretický úvod a výsledky, které jsou prezentovány formou pěti původních vědeckých článků zabývajících se problematikou diagnostických metod založených na PCR. V rámci těchto studií byly optimalizovány a vyvinuty nové molekulární metody využitelné ve třech komplexních oblastech, kterými jsou 1) Detekce Toxoplasma gondii pomocí qPCR; 2) Rychlé odlišení morfologicky nerozlišitelných druhů parazitů pomocí testu křivek tání; a 3) Multiplexní detekce významných gastrointestinálních hlístic přežvýkavců pomocí qPCR. Přístupy, které jsme zavedli, mají značný potenciál pro využití v oblasti bezpečnosti potravin, především pak při zavádění účinných strategií kontroly přenosu parazitárních agens do lidských a živočišných potravinových řetězců.

Abstract:

Currently, infections of alimentary origin are a hot topic worldwide and represent one of the most frequent health risks for both humans and animals, often resulting in substantial socio-economic problems. A common feature of these infections is the entry of the infection into the host organism via the gastrointestinal tract, where transmission can occur directly via the faecal-oral route or indirectly via the intake of nutrients and fluids. The causative agents of these infections are numerous, but the most neglected and underestimated are the unicellular and multicellular parasites. From a global perspective, the most attention is focused on safety of food intended for human consumption, which is undoubtedly linked to the health of livestock and wild animals, which can be important reservoirs of parasitic infections. In light of the ongoing changes affecting the epidemiology of parasitic organisms, driven in particular by globalisation and climate change, it is necessary to remain vigilant and to react quickly in order to adapt surveillance and implement appropriate control policies and prevention strategies. This can be achieved through the introduction of uniform diagnostic methods and tools that are rapid, sensitive and reliable, allowing routine and accurate diagnosis and monitoring of selected pathogens. The current lack of such approaches is partly caused by limited financial resources and competing priorities, and partly due to the difficulty of identifying parasites in different matrices, which is related to their complex life cycles and different transmission routes. The thesis focuses on the application potential of modern molecular methods and tools and their availability for the detection and taxonomic determination of important parasites of alimentary origin, the methods which could be used in parasite epidemiology and ecology as well as in food safety area. In particular, it addresses the development and optimization of suitable PCR-based approaches based on the direct detection of nucleic acids of target pathogens. With regard to the scope of this thesis and the adopted methods, medically and/or veterinary significant parasites of humans, livestock and wildlife were used as model organisms. Specifically, these included the ubiquitous protozoan Toxoplasma gondii, nematodes of the genus Trichinella, and the economically important gastrointestinal nematodes of ruminants such as the haematophagous nematodes Haemonchus contortus and Ashworthius sidemi. The thesis comprises a theoretical introduction and results, which are presented in the form of five original scientific articles concerning the issue of PCR-based diagnostic methods. Within these studies, novel molecular assays were optimized and developed for use in three complex topics, which are: 1) Detection of Toxoplasma gondii using the qPCR; 2) Rapid differentiation of morphologically indistinguishable parasitic species using a high resolution melting assay; and 3) Multiplex detection of significant gastrointestinal nematodes of ruminants using the qPCR. The approaches which we introduced have considerable potential for utilization in the context of food safety issues, i.e. in the implementation of effective strategies for control of the transmission of parasitic agents into human and animal food chains.

Keywords

Diagnostika, Metody založené na PCR, qPCR, HRM, Trichinella spp., Haemonchus contortus, Ashworthius sidemi, Gastrointestinální nematoda, Toxoplasma gondii, Bezpečnost potravin, Infekce zažívacího traktu, Diagnostics, PCR-based methods, Gastrointestinal nematodes, Food safety, Infections of alimentary origin

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 17. 9. 2021

Thesis defence

• Date of defence: 2. 12. 2021
• Supervisor: RNDr. Martin Kašný, Ph.D.
• Reader: Mgr. Barbora Pafčo, Ph.D., Dipl.EVPC Dr.med.vet. Barbara Hinney

Masaryk University

Faculty of Science

Doctoral programme / field:
Ecological and Evolutionary Biology / Parasitology