Optimalizace techniky FLIM-FRET pro výzkum rostlin

Bc. Eliška Blahušová

Master's thesis

Optimization of FLIM-FRET technique for plant research

Abstract:

Protein-proteinové interakce hrají klíčovou roli v regulaci rostlinného vývoje, hormonální signalizace i epigenetických procesů. Prostřednictvím těchto interakcí rostliny reagují na změny v okolním prostředí a řídí zásadní vnitrobuněčné děje. Pro detailní pochopení mechanismů je však nezbytné studovat proteiny přímo v jejich přirozeném prostředí, k čemuž v současné biologii slouží například metoda FLIM-FRET (Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy a Förster Resonance Energy Transfer). Tato diplomová práce se zaměřuje na optimalizaci metody FLIM-FRET a charakterizaci proteinových komplexů v živé rostlinné buňce. První část výzkumu se věnuje vlivu vzdálenosti mezi donorem a akceptorem na efektivitu přenosu energie. Výsledky ukazují, že efektivita FRET není přímo závislá na jejich vzdálenosti, což naznačuje schopnost fluoroforů zaujmout v buňce optimální prostorové uspořádání. Při následné analýze vybraných komplexů ARR2/EIN2-C a AtPWO1/AtSWNΔSET se potvrdilo, že pro úspěšnou detekci interakce je zřejmě rozhodující také vzájemná orientace proteinů s vázanými fluorescenčními značkami. Práce dokládá, že výměna pozic fluorescenčních proteinů (tag swapping) v kombinaci se strukturními modely AlphaFold3 a Chai-1 představuje nezbytný nástroj pro eliminaci falešně negativních výsledků a správnou interpretaci uspořádání proteinových komplexů in vivo.

Abstract:

Protein-protein interactions play a crucial role in the regulation of plant development, hormone signaling, and epigenetic processes. Through these interactions, plants integrate environmental signals and coordinate essential intracellular processes. For a detailed understanding of these mechanisms, it is necessary to study proteins directly in their natural environment, a task for which FLIM-FRET (Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy and Förster Resonance Energy Transfer) serves as a powerful tool in biology. This thesis focuses on verifying the reliability of the method and the subsequent characterization of selected complexes in living plant cells. The first part of the research investigates the effect of the distance between the donor and acceptor on energy transfer efficiency. The results demonstrate that FRET efficiency is not directly dependent on the distance, suggesting the ability of fluorophores to adopt an optimal spatial arrangement within the cell. Subsequent analysis of the ARR2/EIN2-C and AtPWO1/AtSWNΔSET complexes confirmed that the mutual orientation of fluorescent tags is also critical for successful interaction detection. This work demonstrates that tag swapping, in combination with structural models from AlphaFold3 and Chai-1, represents an essential tool for eliminating false-negative results and ensuring the correct interpretation of protein complex arrangements in vivo.

Keywords

FLIM-FRET, FRET efektivita, protein-proteinové interakce, vzdálenost mezi donorem a akceptorem, orientace dipólů, reciproční záměna, FRET efficiency, protein-protein interactions, donor-acceptor distance, dipole orientation, tag swapping

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 14. 5. 2026

Thesis defence

• Date of defence: 22. 6. 2026
• Supervisor: RNDr. Jan Skalák, Ph.D.
• Reader: Ing. Tomáš Janovič, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Science

Master programme / field:
Biochemistry / Analytical biochemistry