Instrumentální a biologické in vitro metody stanovení neurotoxických metabolitů sinic

Bc. Vendula Szmucová

Diplomová práce

Instrumental and biological in vitro methods for analyses of neurotoxic cyanobacterial metabolites

Anotace:

V této diplomové práci se věnuji především neurotoxickým metabolitům sinic a dalším cyanotoxinům – zaměřili jsme se na anatoxin-a a cylindrospermopsin, dále jsme studovali také microcystiny a nodularin. V souladu s cíli experimentální části diplomové práce bylo prvním krokem optimalizace extrakční metody a zakoncetrování vzorku ve vodě, následovala optimalizace metody LC-MS/MS pro detekci neurotoxinů z vody a biomasy. Poté byly analyzovány vzorky laboratorních kultur (poskytnuté RECETOXem) a environmentální vzorky (biomasy), které byly shromažďovány v letech 2012 – 2015 na území České republiky. Biomasy byly vybrány dle taxonomického složení potenciálních producentů neurotoxinů, případně dalších cyanotoxinů. V rámci optimalizace měření byly v jednotlivých matricích instrumentálně určeny limity detekce a kvantifikace pro jednotlivé toxiny, lineární závislosti a poměry kvantifikačních iontů k potvrzení, zda se opravdu jedná o vybrané látky. Druhá část diplomové práce byla zaměřena na analýzu cílových genů pro produkci anatoxinu-a a cylindrospermopsinu, a to metodou PCR (polymerázová řetězová reakce) s agarózovou elektroforézou. Touto metodou byl potvrzen gen cyrJ u environmentálního vzorku, u kterého byl i metodou LC-MS/MS detekován samotný cylindrospermopsin.

Abstract:

In this thesis neurotoxic metabolites of cyanobacteria are studied – mainly we focused on anatoxin-a and cylindrospermopsin, but microcystins and nodularin were also studied. Following the objectives of the thesis, first step was to optimize the extraction SPE in water followed by optimization of the method LC-MS/MS for detection neurotoxins from water and biomass. Then, samples of laboratory cultures (provided by RECETOX) and environmental samples (biomasses), collected in Czech republic in 2012-2015, were analyzed. Biomasses were selected according to taxonomic composition of potencial neurotoxin or other cyanotoxin producers. As a part of optimizing measurements, the basic analytical parameters for each matrixes were determined – limits of detection and quantification for each toxin, linear dependence. Also quantification ions were determined to confirm that we had identified target toxins. The analysis of target genes responsible for production of cyanotoxins (anaC for anatoxin-a and cyrJ for cylindrospermopsin) followed by using Polymerase chain reaction (PCR) with gel electrophoresis. The cyrJ gene was confirmed in the environmental sample, in which cylindrospermopsin was determined by LC-MS/MS.

Klíčová slova

sinice, cyanotoxiny, anatoxin-a, cylindrospermopsin, LC-MS/MS, anaC gen, cyrJ gen, polymerázová řetězová reakce, elektroforéza, biotesty, cyanobacteria, cyanotoxins, anaC gene, cyrJ gene, polymerase chain reaction, electrophoresis, bioassays

Jazyk práce: čeština

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 7. 1. 2019

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 4. 2. 2019
• Vedoucí: prof. RNDr. Luděk Bláha, Ph.D.
• Oponent: Mgr. Ondřej Adamovský, Ph.D.

Masarykova univerzita

Přírodovědecká fakulta

Magisterský studijní program / obor:
Biochemie / Analytická biochemie