Signalizace receptoru gp130 v regulaci diferenciace kmenových buněk

Mgr. Iva Veselá, Ph.D.

Doctoral thesis

Gp130 receptor signalling in regulation of stem cells differentiation

Abstract:

Glykoprotein 130 (gp130) je významná součást transmembránového vysokoafinitního receptorového komplexu, která je zodpovědná za vazbu ligandu i samotnou transdukci signálu. Tento komplex je využíván cytokiny patřícími do IL-6 rodiny, které se vyznačují pleiotropními a redundantními účinky. Gp130 signalizace hraje významnou roli v imunitním, hematopoetickém, nervovém, kardiovaskulárním a endokrinním systému. Deregulace signalizace gp130 se podílí na vzniku mnoha patologických stavů včetně nádorových onemocnění. Tato signalizace je také potřebná k udržení nediferencovaného stavu některých kmenových buněk. Hlavním cytokinem rodiny IL-6 zodpovědným právě za jejich sebeobnovu je leukemii inhibující faktor (LIF). Po jeho navázání k receptorovému komplexu se spouští především tři signální dráhy: JAK/STAT (zodpovědná za udržení sebeobnovy), SHP/ERK (zodpovědná za diferenciaci) a PI3K/AKT (zodpovědná za přežívání). V této práci jsou prezentovány výsledky, které ukazují, že LIF má inhibující účinek na kardiomyogenezi embryonálních kmenových (ES) buněk. Pomocí specifické inhibice STAT3 bylo zjištěno, že za inhibice kardiomyogeneze je pravděpodobně zodpovědná aktivace právě tohoto proteinu. Kromě tohoto účinku byl zkoumán taky vliv LIF na neurogenezi ES buněk. Během pokusů jsme bohužel získávali protichůdné výsledky, které jsou ovšem v souladu s již publikovanými výsledky jiných skupin. Zkušenosti s neurální diferenciací pluripotentních buněk, byly však dále využity pro transplantační experimenty. V těchto experimentech jsme sledovali schopnost těchto buněk přežívat po transplantaci do mozečku dospělých B6CBA myší. Histologické řezy naznačují, že transplantované neurální progenitory vykazují vyšší míru přežívání než nediferencované, pluripotentní buňky. Mechanismy neurální diferenciace jsme se zabývali i dále. Ukázali jsme, že signalizace PI3K, se také může podílet na inhibici neurální diferenciace, která je podpořena působením kyseliny retinové. Inhibice této dráhy významně podporuje neurální diferenciaci ES buněk. Jelikož bylo prokázáno, že aktivita STAT3, cílového transkripčního faktoru signalizace gp130, může být kontrolována hyaluronanem, klíčovou komponentou extracelulární matrix, analyzovali jsme, jak je samotný hyaluronan schopný modulavat diferenciaci ES buněk neurálním směrem. Paralelně jsme tyto testy realizovali i na neurálních progenitorech derivovaných z embryonálního mozku myši. Výsledky našich pokusů ukázaly, že vysoko i nízkomolekulární hyaluronany podporují expresi neuronálních markrů. Nízkomolekulární hyaluronany navíc potlačovaly proliferaci těchto buněk. V souhrnu, naše poznatky naznačují nové mechanismy regulace diferenciace ES buněk a současně nové možnosti zlepšení protokolů diferenciace ES buněk vedoucí k získání vysoce homogenní populace požadovaných progenitorů pro možnosti buněčných transplantací.

Abstract:

Glycoprotein 130 (gp130) is an important part of high-affinity transmembrane receptor complex, that is responsible for ligand binding and signal transduction. This complex is used by IL-6 family cytokines that have pleiotropic and redundant effects. Gp130 signaling plays important roles in immune, hematopoietic, nervous, endocrine and cardiovascular systems. Deregulation of gp130 signaling is partially responsible for many pathological states, including cancer. This signaling is also needed for keeping nondifferetiated state of several stem cells. Main cytokine of IL-6 family responsible for their self renewal is leukemia inhibitory factor (LIF). After its binding to the receptor complex three signaling pathways are activated: JAK/STAT (responsible for self renewal), SHP/ERK (responsible for differentiation) and PI3K/AKT (responsible for survival). Results presented in this thesis points on the role of LIF as inhibitory for cardiomyogenesis of embryonal stem (ES) cells. By specific activation of STAT3 it was found that the inhibition of cardiomyogenesis is probably carried out by inhibition of STAT3. Apart from this finding, effects of LIF on ES cells neurogenesis were also studied. Unfortunately contradictory results were obtained during experiments, but these results were confirming results from other groups reported previously. Experience with neural differentiation of pluripotent cells was further used for transplantation experiments. In these experiments we were studying the ability of these cells to survive after transplantation to the cerebellum of adult B6CBA strain mice. Histological analysis suggests that the transplanted neural progenitors survival rate is higher than that of nondifferentiated pluripotent cells. We were investigating the mechanisms of neural differentiation further on. We showed that the PI3K signaling is also contributing to the inhibition of neural differentiation, which is supported by retinoic acid. Inhibition of this pathway considerably strengthens ES cells neural differentiation. Because the influence of hyaluronan on activity of STAT3, target transcription factor of gp130 signaling, was shown, we analyzed whether hyaluronan itself is able to modulate ES cell differentiation to the neuronal direction. We did these tests also parallely on the neural progenitors derived from embryonal mouse brain. Our results showed that both low and highmolecular hyaluronans support expression of neural markers. Lowmolecular hyaluronans also suppressed proliferation of these cells. In whole, these results suggest new mechanisms of ES cells differentiation regulation and simultaneously new possibilities for improvement of standing ES cells differentiation protocols that would lead to the acquirement of highly homogenous population of the desired progenitors for cell transplantations.

Keywords

kmenové buňky, signalizace gp130, JAK, STAT, cytokiny, LIF, pluripotence, diferenciace

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 6. 11. 2012

Thesis defence

• Date of defence: 13. 12. 2012
• Supervisor: Mgr. Jiří Pacherník, Ph.D.
• Reader: Mgr. Jiří Kohoutek, Ph.D., Ing. Petr Humpolíček, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Science

Doctoral programme / field:
Biology (4-years) / Animal Physiology