Konstrukce rekombinantních DNA sond pro použití v molekulární cytogenetice

Mgr. Kateřina Čábelová, Ph.D.

Doctoral thesis

Construction of recombinant DNA probes for application in molecular cytogenetics

Abstract:

Příprava sond pro fluorescenční in situ hybridizaci zahrnuje širokou škálu technik molekulární biologie. V našem případě byla první metodou Laserová mikrodisekce (LCM), pomocí níž jsme získali genetický materiál - chromosomy či jejich části, jež byly oblastí našeho zájmu. Pracovali jsme s chromosomy vybraných zástupců čeledi Bovidae (Turovití), což je velmi početná čeleď podřádu přežvýkavců. Někteří zástupci patří ke kriticky ohroženým druhům a jejich sekvence DNA jsou v genových bankách zastoupeny velmi vzácně. Laserovou mikrodisekcí jsme získali v průměru 10 kopií chromosomu nebo jeho části. Z důvodu malého množství materiálu, následovala technika DOP PCR, kterou jsme využili k namnožení mikrodisekované DNA. PCR produkty byly klonovány do pDrive cloning vektoru, s využitím Blue-white assaye (modro-bílý test) pro selekci pozitivních klonů. Následovala DOT BLOT analýza, díky níž byla provedena selekce specifických klonů, které byly podrobeny sekvenační analýze a následně značeny fluorochromy nebo hapteny. Takto získané fluorescenčně značené sondy byly použity pro mezidruhovou fluorescenční in-situ hybridizaci. S využitím výše uvedených technik jsme identifikovali Y specifické repetice u vybraných zástupců čeledi Bovidae, z nichž mnohé se ukázaly jako specifické pro určitý druh nebo podčeleď. Izolace a charakterizace nových centromerických sekvencí obohatila genetickou mapu jednotlivých druhů čeledi Bovidae a rozšířila znalosti o struktuře centromer těchto, mnohdy kriticky ohrožených, zvířat.

Abstract:

Probe preparation for fluorescent in situ hybridization includes large scale of molecular biology techniques. The first method in our case was Laser Capture Microdissection (LCM). We applied LCM to obtain genetic material – whole chromosomes and their parts that were in focus of our study. We worked with chromosomes of selected members of family Bovidae, it´s large family of suborder Ruminantia. Some Bovidae members are critically endangered species and their DNA sequences are represented in gene banks rarely. We got 10 copies of chromosome (or part of chromosome) by laser microdissection in average. Due to small amount of material we applied DOP PCR technique to amplify microdissected DNA. PCR products were cloned into pDrive cloning vector with use of Blue-white assaye for positive clone selection. It was followed by a DOT BLOT analysis, which was used for specific clone selection. Subsequently, these clones were processed by sequence analysis and then labelled by fluorochromes or haptens. These fluorescent labelled probes were used in interspecies fluorescent in situ hybridization. We identified Y specific repetitive sequences of selected Bovidae members by techniques specified above. We discovered that many of them are specific for given species or subfamily. Isolation and characterization of new centromeric sequences enriched genetics map of constituent species of family Bovidae. It expanded our knowledge of centromere structures of these, often critically endangered, species.

Keywords

Laserová mikrodisekce, Fluorescenční in situ hybridizace, Komparativní cytogenetika, Y chromosom, Repetitivní DNA, Satelitní DNA, Bovidae

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 26. 6. 2014

Thesis defence

• Date of defence: 3. 10. 2014
• Supervisor: prof. MVDr. Jiří Rubeš, CSc.
• Reader: prof. MVDr. RNDr. Petr Hořín, CSc., prof. RNDr. František Marec, CSc.

Masaryk University

Faculty of Science

Doctoral programme / field:
Biology (4-years) / Genetics