Roles of posttranscriptional modifications in RNA processing

Mgr. Marek Bartošovič, Ph.D.

Doctoral thesis

Abstract:

Posttranskripční úpravy RNA jsou důležitou součástí metabolismu všech živých buněk. V průběhu exprese mRNA nebo zrání ncRNA dochází k velkému množství úprav RNA, což zajištuje produkci funkčních molekul v správném množství a ve správný čas. Mezi nejdůležitější modifikace RNA v eukaryotech patří interní modifikace bázi nukleotidů a modifikace na 3` konci. První část této práce je zaměřena na modifikaci adenosinu na N6-metyladenosin (m6A), která reguluje hned několik metabolických procesů souvisejících s RNA, jako jsou sestřih RNA, export z jádra, translace a degradace RNA. S využitím moderních metod jakými jsou sekvenováni druhé generace, nebo CRISPR-Cas9 jsme byli schopni charakterizovat funkci FTO, demetylázy m6A, v posttransckripčních úpravách mRNA. Ukázali jsme, že FTO se váže na pre-mRNA a že demetylace zprostředkovaná proteinem FTO přednostně způsobuje začleňování alternativních exonů do maturované mRNA. Naše závěry jsou postavené na analýze CLIP-Seq dat na proteinu FTO, RNA-seq analýze buněčné linie která neexprimuje FTO (FTO KO), stejně jako na experimentech s opětovnou expresí variantů divokého typu FTO, či mutantního proteinu v původní linií FTO KO. Druhá část této práce zkoumá funkci NEXT komplexu v RNA metabolizmu. NEXT je složen ze dvou proteinů vázajících RNA - ZCCHC8 a RBM7, a RNA helikázy SKIV2L2 (hMTR4). Jedná se o funkční homolog lidského komplexu TRAMP, který se podílí na stimulaci degradace RNA exosomem. V přiloženém článku (Hroššova a kol., 2015) představujeme NMR strukturu podjednotky komplexu NEXT – proteinu RBM7 a dále popisujeme molekulární podstatu mechanismu rozpoznávaní sekvencí bohatých na uridin komplexem NEXT skrz RBM7. Dále ukazujeme, že vazba komplexu NEXT na snRNA a jejich správné rozpoznání proteinem RBM7 jsou důležité pro správnou úpravu a degradaci prekurzorů snRNA. Rovněž navrhujeme model, podle kterého by RBM7 mohl rozeznávat post-transkripčně uridylovanou RNA.

Abstract:

Posttranscriptional modifications of RNA are an important part of RNA metabolism in all living cells. Multiple RNA processing and modification steps ensure that a proper level of functional mRNA or ncRNA is produced in the right place and at the correct time. The most important RNA modifications in eukaryotes are nucleotide base modifications and 3′ end tailing. The first part of this work is focused on, a recently described, internal modification of adenosine to N6-methyladenosine involved in regulation of multiple RNA metabolic processes such as splicing, nuclear export, translation or RNA decay. By using contemporary and high-throughput methods such as CLIP and CRISPR-Cas9 gene knockout, we were able to characterize the function of the m6A demethylase FTO in mRNA processing. We found that FTO preferentially binds to the pre-mRNA and that the FTO-mediated RNA demethylation triggers alternative exon inclusion. This is supported by our CLIP and RNAseq data as well as by the rescue of FTO KO with WT and mutant FTO. The second part of the thesis investigates the function of the NEXT complex, which is composed of two RNA binding proteins ZCCHC8 and RBM7 and the RNA helicase SKIV2L2 (hMTR4). The NEXT complex is a functional homologue of the human TRAMP complex involved in stimulation of RNA degradation by the exosome. In the attached report by Hrossova et al., we present an NMR structure of the RRM of RBM7 and we propose that the NEXT is targeted to uridine-rich sequences through the RBM7 subunit. We also show that in vivo, RNA targeting by the RBM7 and the NEXT complex is required for proper processing or degradation of snRNAs. Finally, we propose a model in which RBM7 potentially targets post-transcriptionally uridylated RNA molecules.

Keywords

post-transcriptional modifications of RNA, N6-methyladenosine, RNA demethylation, alternative splicing, alternative polyadenylation, nuclear RNA processing Post-transkripční modifikace RNA, N6-metyladenosin, demetylace RNA, alternativní sestřih, alternativní polyadenylace, úprava RNA v jadře

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 27. 9. 2016

Thesis defence

• Date of defence: 30. 11. 2016
• Supervisor: doc. Mgr. Štěpánka Vaňáčová, Ph.D.
• Reader: doc. Mgr. Petr Svoboda, Ph.D., doc. Michael Jantsch

Masaryk University

Faculty of Science

Doctoral programme / field:
Biochemistry (4-years) / Biomolecular Chemistry