Hmotnostní spektrometrie v klinických aplikacích

Mgr. Barbora PISKLÁKOVÁ

Doctoral thesis

Mass Spectrometry in Clinical Applications

Abstract:

V dnešní době jsou laboratorní vyšetření nepostradatelnou součástí lékařských diagnostických postupů a sledování průběhu léčby. Je důležité vyvíjet stále nové metody, které splňují požadavky rozsáhlých nároků v moderní medicíně. Hmotnostní spektrometrie se v posledních dekádách vyprofilovala v analytickou metodu, která našla své uplatnění v mnoha oborech laboratorní diagnostiky, jako je např. toxikologie, infekční onemocnění, terapeutické monitorování léků či dědičné metabolické poruchy. Tato technika je též již nedílnou součástí vědeckých oborů proteomiky, metabolomiky a lipidomiky. V teoretické části této práce jsou zpracovány základní poznatky o hmotnostní spektrometrii včetně typů ionizace a hmotnostních analyzátorů ve spojení se separačními technikami. Dále je představena problematika dědičných metabolických poruch (DMP) a možnosti jejich diagnostiky pomocí hmotnostní spektrometrie. Poslední část teoretické rešerše je věnována analýze přímých orálních antikoagulans, které se používají pro léčbu trombotických nemocí, jakým je i antifosfosfolipidový syndrom. Praktická část je zaměřená na vývoj a validaci metody založené na kapalinové chromatografii ve spojení s tandemovou hmotnostní spektrometrií (LC-MS/MS) pokrývající široké spektrum metabolitů z řady organických kyselin, acylglycinů a acylkarnitinů v moči jakožto alternativy k doposud používané plynové chromatografii ve spojení s hmotnostní spektrometrií (GC-MS). Tento přístup kombinuje jednoduchou a rychlou přípravu vzorku, analýzu a vyhodnocení na základě transformace naměřených dat pomocí robustního škálování. Pro jednoduchou a automatickou vizualizaci dat byly využity multikomponentní krabicové grafy a metabolické sítě biomarkerů. Vyvinutá metoda byla analyticky a klinicky validovaná, bylo již analyzováno více než 1 500 klinických vzorků a pomocí této platformy bylo správně diagnostikováno 34 onemocnění. Pracovní postup umožňuje efektivní, rychlou a citlivou diagnostiku více než 80 DMP. Tento poloautomatizovaný přístup překonává nedostatky GC-MS a má potenciál být moderní alternativou pro diagnostiku organických acidurií. V druhé části této práce byla aplikována LC-MS/MS metoda pro analýzu přímých orálních antikoagulancií u pacientů pozitivních na lupus antikoagulans. Tyto výsledky byly porovnány s rutinně používanými funkčními koagulačními testy, přičemž bylo zjištěno, že oba přístupy poskytují odlišné výsledky. I po vyvázání těchto léčiv z plasmy pacientů pomocí adsorpčních tablet DOAC-Stop nebyla jejich koncentrace za využití funkčních testů výrazně ovlivněna. Bylo tak prokázáno, že antifosfolipidové protilátky přítomné u těchto pacientů interferují s funkčními testy a způsobují falešně pozitivní výsledky.

Abstract:

Nowadays, laboratory tests are an indispensable part of medical diagnostic procedures and monitoring of the course of treatment. It is important to develop new methods that meet the demands of the extensive requirements in modern medicine. In recent decades, mass spectrometry has evolved into an analytical method that has found its application in many fields of laboratory diagnostics, such as toxicology, infectious diseases, therapeutic drug monitoring and inherited metabolic disorders. This technique is also now an integral part of the scientific fields of proteomics, metabolomics and lipidomics. In the theoretical part of this thesis, the basic knowledge of mass spectrometry including types of ionization and mass analyzers coupled with separation techniques is discussed. Furthermore, the field of inherited metabolic disorders and the possibilities of their diagnosis by mass spectrometry are presented. The last part of the theoretical review is devoted to the analysis of direct oral anticoagulants, which are used for the treatment of thrombotic diseases such as antiphospholipid syndrome. The practical part is focused on the development and validation of an LC-MS/MS method covering a wide spectrum of metabolites from a range of organic acids, acylglycines and acylcarnitines in urine as an alternative to the previously used gas chromatography coupled with mass spectrometry. This approach combines simple and rapid sample preparation, analysis and evaluation based on transformation of measured data using robust scaling. Multicomponent box plots and metabolic biomarker networks were used for simple and automatic data visualization. The developed method has been analytically and clinically validated, more than 1,500 clinical samples have already been analyzed and 34 diseases have been correctly diagnosed using this platform. The workflow enables efficient, rapid and sensitive diagnosis of more than 80 IMDs. This semi-automated approach overcomes the shortcomings of GC-MS and has the potential to be a modern alternative for the diagnosis of organic aciduria. In the second part of this work, the LC-MS/MS method was applied for the analysis of direct oral anticoagulants in lupus anticoagulant-positive patients. These results were compared with routinely used functional coagulation assays, and the two approaches were found to give different results. Even after these drugs were removed from the patients' plasma using DOAC-Stop adsorption tablets, their concentrations were not significantly affected using functional assays. Thus, the antiphospholipid antibodies present in these patients were shown to interfere with the functional tests and cause false positive results.

Keywords

kapalinová chromatografie, hmotnostní spektrometrie, dědičné metabolické poruchy, lupus antikoagulans, přímá orální antikoagulancia

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 28. 6. 2024

Thesis defence

• Supervisor: prof. RNDr. David Friedecký, Ph.D.

Palacký University Olomouc

Faculty of Medicine and Dentistry

Doctoral programme / field:
Medical Chemistry and Clinical Biochemistry / Medical Chemistry and Clinical Biochemistry