Identifikace aminokyselin fosforylovaných proteinkinasou GSK3 v proteinu MAP2c

Bc. Róbert Šándor

Bachelor's thesis

Identification of amino acids phosphorylated by protein kinase GSK3 in protein MAP2c

Abstract:

Mikrotubuly hrají klíčovou roli při určování tvaru buňky, slouží k vnitrobuněčnému transportu a koordinují segregaci chromozomů během buněčného dělení. Jsou to velmi nestabilní struktury, které podléhají rychlé polymerizaci a depolymerizaci. Jejich stabilita je regulována pomocnými proteiny, které se nazývají proteiny asociované s mikrotubulami (MAPs). Tyto proteiny zprostředkovávají interakce mikrotubulů s dalšími buněčnými komponenty, propojení vláken a jejich zesíťovaní. Uvnitř neuronů se výskyt různých MAPs liší, některé jsou přítomny především v axonech, např. Tau, a jiné v buněčném těle a dendritech, např. MAP2c.MAP2c a Tau jsou homology klasifikovány jako přirozeně neuspořádané proteiny (IDPs), které nemají dobře definovanou 3D strukturu, ale mají tendenci vytvářet přechodné sekundární struktury. Často podléhají post-translačním modifikacím, zejména fosforylaci různými proteinkinasami. Oba jsou silně fosforylované in vivo. K určení specifických fosforylačních míst jsme použili nukleární magnetickou resonanci (NMR). Tato práce se zaměřuje na identifikaci aminokyselin fosforylovaných v proteinu MAP2c glykogen synthasou kinasou-3β (GSK-3β), všudypřítomným enzymem, který se ve velkém množství vyskytuje v mozku a o němž bylo již dříve zjištěno, že fosforyluje MAP2c. V této práci byl MAP2c exprimován a následně byla zaznamenána 2D 1H15N HSQC spektra proteinu MAP2c fosforylovaného proteinkinasou GSK-3β. 3D experimenty FOSY a CBCA(CO)NH sloužili k identifikaci typů aminokyselin předcházejících fosforovaná rezidua. Kromě toho bylo naměřeno několik 2D 1H15N HSQC spekter mutantů MAP2c, kteří postrádají potenciální fosforylační místa, pro potvrzení přiřazení fosforylovaných reziduí. Ve výsledku se nám podařilo přiřadit většinu píků specifickým fosforylovaným Ser/Thr zbytkům, které se nacházely především v C-koncové oblasti MAP2c. Kromě toho byla změřena série 2D 1H15N SOFAST HMQC spekter za účelem pozorování fosforylace v reálném čase a sledování kinetiky fosforylace. Předchozí fosforylace MAP2c c-AMP dependentní proteinkinasou (PKA) zvýšila aktivitu GSK-3β a rychlost fosforylace reziduí v blízkosti hlavního fosforylačního místa PKA.

Abstract:

Microtubules play pivotal role in determining cell shape, provide platforms for intracellular transport and coordinate chromosome segregation during cell division. They are highly unstable structures, undergoing rapid cycles of polymerization and depolymerization. Their stability is regulated by accessory proteins, named microtubule-associated proteins (MAPs). They mediate interactions of microtubules with other cell components, filament bundling and cross-linking. Inside the neurons, occcurrence of various MAPs differs, as some are present mostly in axons e.g., Tau, and others in the cell body and dendrites e.g., MAP2c. MAP2c and Tau share a high degree of homology and are classified as intrinsically disordered proteins (IDPs), lacking a well-defined 3D structure, but with a propensity to form transient secondary structures. They are subject to frequent post-translational modifications, in particular phosphorylation by various protein kinases. Both of them are heavily phosphorylated in vivo. We used nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy to determine the specific phosphorylation sites. This thesis focuses on identification of amino acids phosphorylated in MAP2c protein by gly-cogen synthase kinase-3β (GSK-3β), a ubiquitous enzyme found in high amounts in the brain, that has been reported to phosphorylate MAP2c previously.In this work, MAP2c was expressed and 2D 1H-15N HSQC spectra of MAP2c phosphorylated by GSK-3β were recorded. Our experiments also included 3D FOSY and CBCA(CO)NH to identify the types of the amino acids preceding the phosphorylated residues. Furthermore, multiple 2D 1H-15N HSQC spectra of MAP2c mutants, lacking potential phosphorylation sites, were acquired for confirmation of the assignment. As a result, we managed to assign most of the peaks to the specific phosphorylated Ser/Thr, which were mainly located at the C-terminal region of MAP2c. Moreover, a serie of 2D 1H-15N SOFAST HMQC spectra was measured in order to observe real-time phosphorylation and monitor the phosphorylation kinetics. Prior phosphorylation by c-AMP dependent protein kinase (PKA) enhanced GSK-3β activity and increased the phosphorylation rate of the residues close to the main PKA phosphorylation site.

Keywords

microtubule-associated protein 2c, phosphorylation, glycogen synthase kinase-3β, protein kinase A, nuclear magnetic resonance, fosforylace, glykogen synthasa kinasa-3β, protein kinasa A, nukleární magnetická rezonance

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 20. 5. 2022

Thesis defence

• Date of defence: 17. 6. 2022
• Supervisor: PhD. Séverine Jansen
• Reader: Mgr. Monika Kubíčková, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Science

Bachelor programme / field:
Biochemistry / Biochemistry