Analýza CYP1-dependentního metabolismu pomocí hyperspektrálního cytometru

Bc. Ema Huščavová

Bachelor's thesis

Analysis of CYP1-dependent metabolism by hyperspectral cytometry

Abstract:

Benzo[a]pyrene (BaP) is a polycyclic aromatic hydrocarbon found in polluted air or cigarette smoke. Following its metabolic activation catalyzed by cytochrome P450 family 1 (CYP1) enzymes, it exerts genotoxic and carcinogenic effects. Expression of CYP1 enzymes is under control of the aryl hydrocarbon receptor (AhR) and it may lead to the production of various types of metabolites. In this bachelor thesis, we tried to verify the possibility of developing a new method of screening CYP1A activity in living cells (cultured in vitro) by hyperspectral flow cytometry, based on the fluorescence of BaP metabolites. For the experiments, we used the human breast adenocarcinoma cell line MCF7 with a well-characterized BaP metabolism previously analysed in our laboratory. For comparison, we used MCF7 AhR knockout cell line. We observed increased fluorescence depending on BaP concentration, and we found significant differences in fluorescence between wild-type cells and AhR knockout cells. Our results suggest that the analysis of BaP metabolism by spectral cytometry could be useful, especially for comparing the metabolism of polycyclic aromatic hydrocarbons with modified CYP1 or AhR functions.

Abstract:

Benzo[a]pyrén (BaP) je polycyklický aromatický uhľovodík vyskytujúci sa v znečistenom ovzduší či cigaretovom dyme. Po metabolickej aktivácii katalyzovanej cytochrómami P450 rodiny 1 (CYP1) má genotoxické a karcinogénne účinky. Expresia CYP1 je riadená receptorom pre aromatické uhľovodíky (AhR) a môže viesť k produkcii rôznych typov metabolitov. V tejto bakalárskej práci sme sa pokúsili overiť možnosť vývoja novej metódy skríningu aktivity enzýmov CYP1A v živých bunkách (kultivovaných v in vitro podmienkach) pomocou hyperspektrálnej prietokovej cytometrie s využitím fluorescencie metabolitov BaP. V experimentoch sme použili bunkovú líniu MCF7 odvodenú z ľudského adenokarcinómu prsníka, pre ktorú bol v predchádzajúcich experimentoch dobre charakterizovaný metabolizmus BaP. Pre porovnanie slúžil variant línie MCF7 s neexprimujúcim AhR, s veľmi nízkou expresiou CYP1 enzýmov. V práci sme preukázali nárast detekovanej fluorescencie v závislosti na koncentrácii BaP a výrazný rozdiel fluorescencie medzi bunkami MCF7 s AhR a bez AhR. Naše výsledky ukazujú, že analýza metabolizmu BaP pomocou spektrálnej cytometrie je využiteľná pre porovnanie metabolizmu polycyklických aromatických uhľovodíkov po ovplyvnení funkcií CYP či AhR.

Keywords

Hyperspektrálna prietoková cytometria, cytochrómy P450, Ah receptor, polycyklické aromatické uhľovodíky, benzo[a]pyrén, fluórantén, α-naftoflavón

Language used: Slovak

Date on which the thesis was submitted / produced: 3. 1. 2020

Thesis defence

• Date of defence: 7. 2. 2020
• Supervisor: prof. RNDr. Jan Vondráček, Ph.D.
• Reader: Mgr. Martina Hýžďalová, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Science

Bachelor programme / field:
Applied Physics / Medical Physics