Metody diagnostiky vybraných virů ovocných plodin s využitím PCR

Mgr. Lucie Valentová

Doctoral thesis

Diagnostic methods of selected viruses of fruit crops using PCR methods

Abstract:

Tato práce se zabývá problematikou diagnostiky rostlinných virů ovocných plodin, zejména metodou na principu real-time PCR. Tyto detekční systémy jsou jedněmi z nejcitlivějších metod pro detekci virů (nejen) v rostlinách a pro některé viry, např. LChV-1, LChV-2, BRV, SMoV, SCV, jsou v současnosti i jediným možným způsobem jejich diagnostiky, neboť pro ně neexistují detekční protilátky. V rámci disertační práce byly vyvinuty a validovány multiplexní detekční systémy pro viry maloplodosti třešně LChV-1 a LChV-2, pro viry jahodníku SMYEV, SCV, SVBV, SMoV, SPV-1, StrV-1 a OLV 1 a pro viry rybízu BRV a GVBaV. Pro jednotlivé viry byla provedena analýza dostupných diagnostických metod a byly navrženy nové detekční systémy v multiplexním uspořádání, které byly validovány pro použití v moderní diagnostické laboratoři, která se musí řídit mezinárodními standardy pro zajištění věrohodného testování. Validace proběhla dle validačního schématu metodiky EPPO PM 7/98 (5) Specific requirements for laboratories preparing accreditation for a plant pest diagnostic activity. Během validace byly stanoveny výkonnostní parametry (specificita, senzitivita, opakovatelnost a reprodukovatelnost) pro jednotlivé PCR reakce. Zároveň bylo ověřeno, že specificita a senzitivita detekčních systémů konkrétních virů je shodná v multiplexním i v simplexním uspořádání. Pomocí validovaného systému pro detekci virů maloplodosti třešně LChV-1 a LChV-2 byl proveden průzkum výskytu virů v produkčních výsadbách třešní a višní na území České republiky. Z výsledků testování byla např. zjištěna korelace mezi výskytem LChV-2 a stářím sledovaných stromů. Detekční systémy pro testování virů jahodníku byly využity během hodnocení hospodářské škodlivosti viru StrV-1 a pro monitoring přítomnosti virů v rostlinném materiálu, který byl odebrán např. v produkčních výsadbách, v rostlinách uchovávaných v technické izolaci v certifikačním stupni superelita nebo v nakoupené sadbě. Diagnostickou soupravou pro stanovení virů rybízu byl zmapován výskyt virů BRV a GVBaV na území ČR. Výskyt jednotlivých virů byl v řadě testovaných materiálů potvrzen. Výsledky poukazují na smysluplnost vývoje daných detekčních systémů a monitorování jednotlivých virů v testovaných skupinách vzorků. Multiplexování primerů pro detekci více virů jedné plodiny do jedné reakce navíc celé testování zjednodušuje, zrychluje a v neposlední řadě zlevňuje. Všechny diagnostické systémy byly poskytnuty laboratoři ÚKZÚZ, která je již využívá pro testování zdravotního stavu rostlin při kontrole rozmnožovacího materiálu.

Abstract:

This thesis deals with the problem of diagnostics of plant viruses of fruit crops, especially by the method based on the principle of real-time PCR. These detection systems are one of the most sensitive methods for detection of viruses not only in plants and for some viruses, e.g. LChV-1, LChV-2, BRV, SMoV, SCV, they are currently the only possible way of their diagnosis as no detection antibodies for them exist. In the framework of this thesis, multiplex detection systems were developed and validated for sweet and sour cherry viruses LChV 1 and LChV-2, for strawberry viruses SMYEV, SCV, SVBV, SMoV, SPV-1, StrV-1 and OLV 1, and for currant viruses BRV and GVBaV. For each virus, an analysis of available diagnostic methods was carried out, and new detection systems in a multiplex arrangement were designed and validated for use in a modern diagnostic laboratory that must follow international standards to ensure reliable testing. Validation was done according to the validation scheme of EPPO PM 7/98 (5) Specific requirements for laboratories preparing accreditation for a plant pest diagnostic activity. During the validation, the performance parameters (specificity, sensitivity, repeatability and reproducibility) for each PCR reaction were determined. Concurrently, it was verified that the specificity and sensitivity of the detection systems for specific viruses were identical in both multiplex and simplex arrangements. Using a validated system for the detection of LChV-1 and LChV-2, a survey of virus occurrence in production plantations of cherries in the Czech Republic was carried out. The results of the testing showed, for example, a correlation between the occurrence of LChV-2 and the age of the monitored trees. The detection systems for strawberry virus testing were used during a study of StrV-1 economic impacts and for monitoring the presence of the viruses in plant material collected e.g. in production plantings, in nuclear stock kept in technical isolation as super elite or in purchased seedlings. The presence of BRV and GVBaV viruses in the territory of the Czech Republic was mapped using the currant virus diagnostic kit. Occurrence of individual viruses was confirmed in many materials tested. The results point to the usefulness of the development of the detection systems and monitoring of individual viruses in the tested groups of samples. Moreover, multiplexing primers for the detection of multiple viruses infecting one crop into one reaction simplifies, speeds up and also makes the whole testing cheaper. All diagnostic systems were provided to the laboratory of the ÚKZÚZ, which already uses them to test the health status of plants during the control of propagation material.

Keywords

real-time PCR, rostlinné viry, validace, diagnostika, ovocné plodiny

Keywords

plant viruses, real-time PCR, validation, diagnostics, fruit crops

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 25. 1. 2023

Thesis defence

• Supervisor: prof. Ing. Pavel Ryšánek, CSc.

Czech University of Life Sciences Prague

Faculty of Agrobiology, Food and Natural Resources

Doctoral programme / field:
Agricultural Specialization / Agricultural and Forestry Phytopathology and Plant Protection