Strukturní podstata stabilizace proteinů

Bc. Antonín Kunka

Diplomová práce

Structural base of protein stabilisation

Anotace:

Tato práce pojednává o stabilitě proteinů a experimentálních přístupech k jejímu měření. Vzhledem ke své vysoké specificitě a ekologičnosti jsou proteiny zajímavé pro různé biotechnologické aplikace. Jejich relativně malá stabilita, ovlivňující ekonomickou stránku procesu, však často brání jejich širšímu uplatnění. Stabilní proteiny, schopné delší dobu pracovat za extrémních podmínek, například při zvýšené teplotě, lze vyvinout pomocí metod proteinového inženýrství. Současné výpočetní metody pro design stabilních proteinů jsou převážně založené na analýze již dostupných informací, a proto vyžadují přesná experimentální data získaná měřením energetických změn při sbalování a rozbalování proteinů v roztoku. Nejčastěji se studují malé, globulární proteiny, jejichž mechanismus rozbalování lze aproximovat jednoduchými modely. Analýza složitějších systému, například multi-doménových proteinů, představuje komplexní úkol, který vyžaduje použití složitějších modelů. V této práci byly kombinovány různé biofyzikální techniky měření rozbalování proteinů, a získané informace byly poté analyzovány globálně pomocí matematických modelů. Tento typ analýzy umožnil charakterizovat mechanismus rozbalování a zároveň kvantifikovat energetické změny vedoucí ke stabilizaci dvou modelových proteinů: halogenalkandehalogenasy DhaA a fibroblastového růstového faktoru FGF2 a jejich stabilních variant. Na prvním modelovém systému byly demonstrovány výhody kombinace rovnovážného a kinetického měření. Analýza druhého modelového proteinu byla provedena kombinací výsledků rovnovážných měření různými technikami a následnou globální analýzou. Cenné poznatky a informace, získané výše uvedeným způsobem, lze implementovat do predikčních výpočetních algoritmů pro identifikaci stabilizujících změn, a tak zvýšit jejich účinnost a umožnit jejich aplikaci na další proteiny.

Abstract:

This Thesis is focused on protein stability and the experimental approaches for stability measurements. Due to their specific properties and low impact on the environment, proteins are used in various biotechnological applications. However, marginal stability of the proteins represents major limitation for the economical feasibility of their application. Therefore, protein engineering techniques aim to enhance protein stability so that they could operate at higher temperatures for longer periods of time. Current computational methods for the design of stable proteins are mainly data-driven and are very much dependent on the precise experimental data obtained by determination of energetic changes during protein (un)folding in solution. The use of current experimental approaches for stability measurements is often limited to only small proteins, which (un)folds according to a simple two-state model. Analysis of unfolding of larger, multi-domain proteins represents a difficult task. In this Theses, different biophysical techniques are combined and analyzed globally by mathematical models to unravel unfolding mechanism and to characterize stability of two model proteins: haloalkane dehalogenase DhaA and fibroblast growth factor FGF2, and their engineered stable variants. Using this workflow, the energetics of the unfolding and key factors responsible for the stabilization of the model proteins have been described. The advantages and benefits of the combination of equilibrium and kinetic measurements are demonstrated on the DhaA case, whereas combination of different equilibrium techniques and their global analysis is shown on the FGF2 case. Moreover, the experimental results can be subsequently used to strengthen the computational prediction algorithms, which can be then applied on wide variety of other proteins.

Keywords

Stabilita, stabilizace, sbalování proteinů, rozbalování proteinů, termodynamika, diferenční skenovací kalorimetrie, cirkulární dichroismus, fluorescenční spektroskopie, fibroblastový růstový faktor 2, FGF2, halogenalkandehalogenasa, DhaA

Jazyk práce: angličtina

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 16. 5. 2016

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 8. 6. 2016
• Vedoucí: prof. RNDr. Zbyněk Prokop, Ph.D.

Masarykova univerzita

Přírodovědecká fakulta

Magisterský studijní program / obor:
Biochemie / Biochemie