Analýza buněčných procesů v antigen prezentujících buňkách při podání rekombinantního antigenu in vitro

Bc. Denisa ŠTANCLOVÁ

Diplomová práce

Analysis of cellular processes in antigen presenting cells by recombinant protein pulsing in vitro

Anotace:

Antigen prezentující buňky tvoří důležitou součást imunitního systému. Vyznačují se schopností prezentovat antigeny buňkám adaptivního imunitního systému. Za hlavní APC jsou považovány dendritické buňky (DC). Ty totiž disponují nejen schopností vázat exogenní antigen klasicky na MHCII molekuly, ale i zkříženě prezentovat tento antigen na MHCI molekulách. DC jsou takto schopny zprostředkovat nejen CD4+ T-lymfocytární odpověď, ale i cytotoxickou CD8+ T-lymfocytární imunitní odpověď, která hraje zásadní roli při virových infekcích nebo nádorových onemocnění. Cílem diplomové práce bylo analyzovat cestu prezentace RBD domény spike proteinu (RBDS) izolovaného z koronaviru SARS-CoV-2. Studie byla realizována na buňkách cDC1 MutuDC ošetřených sadou inhibitorů zkřížené prezentace. Tyto buňky byly poté pulzovány rekombinantním proteinem RBDS. Výsledky buněčné odezvy byly analyzovány metodou spektrální průtokové cytometrie, pomocí níž byla sledována změna exprese aktivačních a diferenciačních markerů. Výsledky experimentu ukázaly, že protein RBDS může být prezentován nejen klasickou cestou, ale také cestou zkříženou. CRISPR/Cas9 je prokaryotický adaptivní imunitní systém, který zajišťuje rezistenci vůči bakteriofágům či plazmidům. Systém umožňuje prostřednictvím nukleázy Cas9 a vodící sgRNA indukovat vypnutí, zapnutí nebo záměnu genu za jiný. V diplomové práci byla technika CRISPR/Cas9 použita k přípravě knock-outované buněčné linie cDC1 MutuDC pro gen TAP1 a B2M. Pro účely experimentu byla u buněk optimalizována transfekční metoda nukleofekce pomocí elektroporačního programu D-032 a U-001. Nejvhodnějším programem pro transfekci buněk MutuDC je U-001. Experimentální práce se také zabývala přípravě CRISPR/Cas9 vektoru pro knock-out manózový receptor MRC1 exprimovaného na povrchu DC za použití technik molekulárního klonování. Pro vnesení genu MRC1 kódujícího protein Cas9 byl použit vektor pX458 nesoucí gen pro rezistenci k ampicilinu. Přítomnost inzertu ve vektoru pX458 byla úspěšně ověřena restrikční analýzou. Takto upravené buněčné linie mohou sloužit jako efektivní nástroj studia prezentace antigenů.

Abstract:

Antigen-presenting cells are an important part of the immune system. Their main function is to present antigens to cells of the adaptive immune system. Dendritic cells (DCs) are regarded as the main APCs. These have not only the ability to bind exogenous antigen classically to MHCII molecules but also to cross-present this antigen on MHCI molecules. DCs are thus able to mediate not only the CD4+ T-lymphocyte immune response but also the cytotoxic CD8+ T-lymphocyte immune response against viral infections or cancer cells. The main aim of the thesis was to analyse the pathway of cross-presentation of the RBD domain of spike protein (RBDS) isolated from the coronavirus SARS-CoV-2. For experiments, cDC1 MutuDC cells treated with a set of cross-presentation inhibitors, were used. These cells were then pulsed with recombinant RBDS protein. The results of the cellular response were analysed by spectral flow cytometry method for monitoring the change in the expression of activation and differentiation markers. The results of experiments prove that the RBDS protein can be presented not only by the classical pathway but also by the process of cross-presentation. CRISPR/Cas9 is a prokaryotic adaptive immune system that provides resistance to bacteriophages or plasmids. The system makes it possible to induce to switch-off, switch-on or exchange of a gene by means of the Cas9 nuclease and the sgRNA. The CRISPR/Cas9 method was used to prepare a knock-out cell line cDC1 MutuDC for the TAP1 and B2M genes in this diploma. The transfection method of nucleofection was optimized in the cells using the electroporation program D-032 and U-001. The most suitable program for transfection of MutuDC cells is U-001. The experimental work was also devoted to the preparation of a CRISPR/Cas9 vector for the knock-out mannose receptor MRC1 expressed on the surface of DCs using molecular cloning techniques. The pX458 vector carrying the ampicillin resistance gene was used to introduce the MRC1 gene encoding the Cas9 protein. The presence of the insert in the pX458 vector was successfully verified by restriction analysis. Such modified cell lines could serve as a perfect tool for antigen presentation studies.

Klíčová slova

Dendritické buňky, hlavní histokompatibilní komplex, rekombinantní protein, CRISPR/Cas9, průtoková cytometrie

Jazyk práce: čeština

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 29. 4. 2021

Obhajoba závěrečné práce

• Vedoucí: Mgr. Kateřina Zachová, Ph.D.

UNIVERZITA PALACKÉHO V OLOMOUCI

Přírodovědecká fakulta

Magisterský studijní program / obor:
Biologie / Molekulární a buněčná biologie